1. Vue d'ensemble

Le cours traite du génie génétique, une technologie de manipulation de l’ADN et de l’ARN, in vivo ou in vitro. Il porte sur l’identification, l’étude, l’isolement et l’expression des gènes ainsi que leurs fonctions. Cet ensemble de techniques est crucial pour produire des protéines recombinantes, diagnostiquer des maladies, et créer des organismes génétiquement modifiés (OGM). Le cours couvre l’histoire du génie génétique, les techniques d’extraction d’ADN/ARN, l’usage des enzymes, l’électrophorèse, l’hybridation moléculaire, les sondes nucléotidiques, les vecteurs de clonage, le clonage moléculaire, la PCR, et la construction de mutants.

2. Concepts clés & Éléments essentiels

Définition et applications du génie génétique : manipulation de l’ADN/ARN pour étudier la structure, l’expression et la fonction des gènes, applications en biotechnologie.
Histoire : clés des découvertes majeures (1953 modèle ADN, enzymes, transcriptase inverse, clonage, PCR, génome humain, CRISPR).
Extraction ADN/ARN : méthode organique (phénol/chloroforme), séparation des phases, digestion ciblée par RNAse/DNase, précipitation par éthanol; techniques sur colonne (silice/cationique).
Extraction ADN plasmidique : lyse au SDS, utilisation NaOH pour dénaturation, neutralisation avec acétate potassium, séparation ADN plasmidique/genomique.
Enzymes principales :
- Endonucléases de restriction (types I, II, III) et leurs sites palindromiques.
- Types de coupures : franches (PvuII), bouts collants 5' (EcoRI), bouts collants 3' (PstI).
- Autres nucléases : DNAse 1, Nucléase S1, RNAse H.
- ADN polymérases classiques et modifiées (Klenow, Transcriptase inverse, Taq thermosensible).
- Autres enzymes : phosphatase alcaline, polynucléotide kinase, ADN ligase, topoisomérase.
Electrophorèse des acides nucléiques :
- Séparation selon taille et conformation.
- Conditions dénaturantes/non dénaturantes.
- Applications : carte de restriction, polymorphisme, SSCP, séquençage, Northern blot.
Hybridation moléculaire :
- Complémentarité des brins, réversibilité.
- Température de fusion (Tm), facteurs influençant Tm (taille, %GC, sel, agents dénaturants).
- Stringence pour sélectionner hybridations spécifiques.
Sondes nucléotidiques :
- Types : ADN oligosondes, ARN ribosondes.
- Marquage radioactif ou non radioactif (biotine, digoxygénine).
- Techniques de marquage : extrémité 5’ kinase T4, extrémité 3’ terminal transfertase, marquage uniforme.
Blotting (Southern, Northern, Dot blot, Western) :
- Transfert gel à membrane, fixation, hybridation sonde, détection.
Vecteurs de clonage :
- Plasmides (origine réplication, sites insertion, gènes résistance et identification).
- Vecteurs viraux (phage lambda, BAC, YAC).
- Différence voies lysogénique et lytique.
Clonage moléculaire : étapes (préparation ADN, préparation vecteur, ligation, transformation, sélection, expression).
Banques d’ADN génomiques et complémentaires (ADNc) :
- Construction, importance des équivalents génomiques pour couverture complète.
PCR :
- Principe (dénaturation, hybridation amorces, synthèse par TAQ).
- RT-PCR pour amplification à partir d’ARN.
- PCR quantitative en temps réel.
Construction de mutants (exposé bref, TD3).

3. Points à Haut Rendement

Génie génétique = ADN recombinant + manipulation in vivo / in vitro.
Découvertes clées : Watson-Crick (1953), ADN polymérase (1955), endonucléases (1962), ligase (1966), transcriptase inverse (1970), clonage (1972-73), PCR (1985).
Méthode organique extraction : phénol/chloroforme, trois phases après centrifugation.
ADN plasmidique libre de protéines vs ADN génomique associé.
Type II endonucléase : coupe à l’intérieur de sites palindromiques 4-6 nt.
Coupures franches = extrémités nettes, cohésives = bouts collants (5' ou 3').
ADN polymérase Klenow = fragment enzymatique ADN pol I sans activité 5’-3’ exonucléase.
TAQ pol : thermostable, err 1/5000 nt, pas activité exonucléase 3’-5’.
Electrophorèse agarose : fragments 100-50000 nt, polyacrylamide pour meilleure résolution.
Tm calcul : $$ Tm = 81.5 + 16.6 \cdot \log(Na^+) + 0.41 \cdot (%GC) - 0.63 \cdot (\text{formamide}) - \frac{600}{n} $$
Southern blot cible ADN, Northern ARN, Western protéines.
Phage lambda : génome ADN double brin linéaire avec extrémités cos cohésives, circularisation et voies lysogénique/lytique.
Banque ADN génomique : 5 équivalents génomiques nécessaires, calcul formel pour 99% de probabilité.
PCR cycle : nombre molécules $$N = 2^n \cdot N_0$$
RT-PCR permet quantification ARN messager.

4. Tableau de Synthèse

Concept	Points Clés	Notes
Génie génétique	Manipulation ADN/ARN in vivo/in vitro, applications	Vaccins, OGM, diagnostic
Enzymes	Restriction, ligase, polymérases, nucléases spécifiques	Type II EDR reconnaissent site
Extraction ADN/ARN	Méthode phénol/chloroforme, séparation phases	RNase/DNase digestion ciblée
Electrophorèse	Séparation selon taille et conformation	Agarose (grossier), polyacrylamide (fin)
Hybridation moléculaire	Complémentarité brins, Tm, stringence	Agent dénaturant influe Tm
Sondes nucléotidiques	ADN/ARN, marquage radio ou ligand	Kinase T4, Terminal transferase
Vecteurs de clonage	Plasmides, virus, BAC, YAC	Origine réplication, résistance
Clonage moléculaire	Insertion ADN dans vecteur, ligation, transformation	Phénotypique, immunochimie
PCR	Amplification ADN, TAQ pol thermostable	RT-PCR pour ARN, qt-PCR
Banques ADN	Complètes avec 5 équivalents génomiques	ADNc pour expression

5. Mini-Schéma (ASCII)

Génie Génétique
 ├─ Histoire & découvertes
 ├─ Extraction ADN/ARN
 │    ├─ Méthode organique (phénol/chloroforme)
 │    └─ Colonnes silice/cationique
 ├─ Enzymes
 │    ├─ Endonucléases de restriction (types I, II, III)
 │    ├─ Polymérases (Klenow, TAQ, transcriptase inverse)
 │    └─ Ligase, kinases, phosphatases, topoisomérases
 ├─ Electrophorèse
 │    ├─ Agarose (non/dénaturante)
 │    └─ Polyacrylamide (précision)
 ├─ Hybridation moléculaire
 │    ├─ Complémentarité, Tm, stringence
 │    └─ Types de sondes & marquage
 ├─ Blotting
 │    ├─ Southern (ADN)
 │    ├─ Northern (ARN)
 │    └─ Western (protéine)
 ├─ Vecteurs de clonage
 │    ├─ Plasmides
 │    └─ Virus (phage lambda, BAC, YAC)
 ├─ Clonage moléculaire
 │    ├─ Préparation ADN et vecteur
 │    ├─ Ligation
 │    └─ Transformation & sélection
 └─ PCR
      ├─ Principes & cycles
      └─ RT-PCR qPCR

6. Bullets de Révision Rapide

Génie génétique = manipulation ADN/ARN in vivo/in vitro.
Hybridation = appariement par complémentarité base azotée et réversible.
Endonucléase type II : coupe à l’intérieur de site palindromique (4-6 nt).
PvuII = coupure franche, EcoRI = bout collant 5’, PstI = bout collant 3’.
Polymérase TAQ : thermostable, pas d’activité exonucléase 3’-5’, erreur 1/5000.
Extraction ADN organique : séparation 3 phases par centrifugation.
Gel agarose support électrophorèse fragments 100-50,000 nt.
Tm dépend taille, %GC, sel, agents dénaturants.
Sonde ADN dénaturée à T > Tm, hybridation à T < Tm.
Southern blot = ADN, Northern = ARN, Western = protéines.
Vecteur plasmidique : origine réplication, site clonage, résistance antibiotique.
Phage lambda : génome ADN linéaire cos, circularisation, cycles lysogénique/lytique.
Banque génomique complète = 5 équivalents génomiques.
PCR : dénaturation (92°C), hybridation amorces (Tm), synthèse (72°C).
RT-PCR : conversion ARN→ADNc avant PCR.
Miniprep = 15 µg ADN plasmidique, maxiprep = 500 µg.
Ligation requiert extrémités compatibles, déphosphorylation si besoin pour éviter recircularisation.
Electrotransformation, liposomes, micro-injection, infection virale = méthodes d’introduction ADN.
SSCP = détection polymorphismes par conformation ADN simple brin.

Fiche de Révision : Génie Génétique

1. 📌 L'essentiel

Le génie génétique consiste à manipuler ADN/ARN in vivo ou in vitro pour étudier, identifier ou moduler la fonction des gènes.
Les techniques clés incluent l'extraction, la digestion enzymatique, l'électrophorèse, l'hybridation, le clonage, la PCR, et la construction de mutants.
Les enzymes principales : endonucléases de restriction (types I, II, III), ligases, polymérases, nucléases.
Vecteurs principaux : plasmides, phages, BAC, YAC; utilisés pour le clonage.
La PCR permet une amplification ciblée d'ADN, avec différentes variantes (RT-PCR, qPCR).
La hybridation moléculaire repose sur la complémentarité, avec une importance cruciale de la température de fusion (Tm).
Blotting : Southern (ADN), Northern (ARN), Western (protéines).
La banque génomique doit couvrir 99% du génome, en utilisant environ 5 équivalents génomiques.
La technique d'extraction organique repose sur la séparation phases par centrifugation (phénol/chloroforme).

2. 🧩 Structures & Composants clés

ADN plasmidique — dérivé bactérien, autonome en replication, vecteur de clonage.
Endonucléases de restriction — recognition palindrome, coupent à l’intérieur de sites spécifiques.
Polymérases (Taq, Klenow, transcriptase inverse) — synthétisent ou copient ADN/ARN.
Sondes nucléotidiques — ADN ou ARN marqués pour détection, hybridation ou culture.
Vecteurs viraux (phage λ, BAC, YAC) — facilitent le clonage de grands fragments d’ADN.
Electrophorèse — technique de séparation selon taille et conformation.
Blotting (Southern, Northern, Western) — transfert d’ADN/ARN/protéines sur membrane.
Banques d’ADN — conservations d’échantillons pour étude à long terme.
PCR — étape d’amplification ciblée par cycles successifs.

3. 🔬 Fonctions, Mécanismes & Relations

Les enzymes de restriction reconnaissent et coupent des sites palindromiques pour fragmenter l’ADN.
La ligase assemble les fragments d’ADN en comblant les brins d'extrémité cohésives ou blanches.
La PCR amplifie spécifiquement un fragment d’ADN grâce à des amorces complémentaires, avec cycle de dénaturation, hybridation, synthèse.
Les sondes nucléotidiques hybrident spécifiquement avec leur séquence complémentaire, permettant détection précise.
La hybridation est régulée par la température de fusion (Tm) : hybridation optimale sous T < Tm.
La construction de banques permet de stocker l’ensemble du génome ou transcripts.
La technique de Southern blot détecte l’ADN, Northern l’ARN, Western les protéines sur membrane.
La transformation bactérienne ou virale introduit avec succès l’ADN dans le système hôte.
La construction de mutants modifie spécifiquement le génome pour étude fonctionnelle.

4. Tableau comparatif des enzymes de restriction

Élément	Caractéristiques clés	Notes / Différences
Type I	Recognition complexe, coup aléatoire, activité multifonctionnelle	Non utilisé en clonage précis
Type II	Recognition simple, coupe à l’intérieur du site palindromique	La plus utilisée (EcoRI, PstI, PvuII)
Type III	Recognition simple, coupe à proximité du site reconnu	Moins fréquent en clonage

5. 🗂️ Diagramme Hiérarchique

Génie Génétique
 ├─ Extraction ADN/ARN
 │    ├─ Méthode organique
 │    └─ Colonnes
 ├─ Enzymes de restriction
 │    ├─ Type I
 │    ├─ Type II
 │    └─ Type III
 ├─ Clonage et Vecteurs
 │    ├─ Plasmides
 │    ├─ Vecteurs viraux
 │    └─ YAC, BAC
 ├─ Amplification
 │    ├─ PCR (classique, RT, qPCR)
 │    └─ Mutagenèse dirigée
 ├─ Hybridation
 │    ├─ Sondes radioactives ou non
 │    └─ Détection (Southern, Northern, Western)
 └─ Applications
      ├─ Production protéines recombinantes
      ├─ Diagnostic génétique
      └─ Création d’OGM

6. ⚠️ Pièges & Confusions fréquentes

Confondre coupure franche (lisse) et bout collant (cohésif).
Optimiser la température de hybridation, ne pas utiliser T trop élevé ou trop faible.
Ne pas confondre les vecteurs : plasmides vs phages vs YAC/BAC.
Mal interpréter Tm : il dépend aussi de la concentration en ions.
Confondre Southern et Northern blot (ADN vs ARN).
Croire que tous les enzymes reconnaissent le même site — chaque enzyme est spécifique.
Négliger la nécessité de déphosphoryler le vecteur pour éviter la recircularisation.
Sous-estimer la quantité d’ADN nécessaire pour couvrir le génome dans une banque.
Oublier que PCR peut produire des erreurs (taux d’erreur de Taq).

7. ✅ Checklist Examen Final

Définir le génie génétique et ses principales applications.
Identifier les différents types d’enzymes de restriction et leur mode d’action.
Expliquer la méthode d’extraction organique ADN/ARN.
Connaître le fonctionnement de l’électrophorèse et sa résolution.
Définir Tm et ses facteurs d’influence.
Différencier Southern, Northern, Western blot.
Connaître la structure et le rôle des vecteurs clonaux.
Décrire le processus de clonage moléculaire.
Expliquer le principe de la PCR et de la RT-PCR.
Comprendre la construction et la signification des banques d’ADN.
Être capable d’interpréter un tableau comparatif des enzymes.
Éviter les confusions : coupure, hybridation, vecteurs, techniques.

Ce document synthétise les points clés pour maîtriser le cours de génie génétique en vue de l’examen. Bonne révision !

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1. 📌 L'essentiel

2. 🧩 Structures & Composants clés

3. 🔬 Fonctions, Mécanismes & Relations

4. Tableau comparatif des enzymes de restriction

5. 🗂️ Diagramme Hiérarchique

6. ⚠️ Pièges & Confusions fréquentes

7. ✅ Checklist Examen Final

Introduction au génie génétique

Introduction au génie génétique

Quels sont les principaux usages du génie génétique tels que présentés dans ce cours?

Introduction au génie génétique

Progression globale

Détail par thème

Introduction au système

Les différents types

Structure axiale

Structure appendiculaire

Suivi de progression par thème