Fiche de révision : Édition génomique et recombinaison

📋 Plan du Cours

1. Applications de l’édition génomique
2. Types de modifications génétiques
3. Modulation de l’expression génique
4. Réparation des cassures ciblées
5. Système CRISPR-Cas bactérien
6. Découverte de CRISPR-Cas9
7. Application de CRISPR-Cas9 à l’édition
8. Reconnaissance de la séquence PAM
9. Atouts de CRISPR face aux nucléases
10. Variantes des outils CRISPR
11. Recombinaison homologue et KO constitutifs
12. Recombinaison site-spécifique conditionnelle
13. Systèmes inductibles de recombinaison

📖 1. Applications de l’édition génomique

🔑 Notions clés & Définitions

• Édition génomique : Modification du génome avec une haute précision pour inactiver un gène, insérer un nouveau gène ou fragment d’ADN, introduire une mutation ciblée ou corriger une mutation spécifique.

★ À maîtriser

• Les animaux transgéniques permettent de modéliser des maladies humaines dans un environnement plus contrôlé, d’en reproduire certaines caractéristiques ou symptômes, d’étudier le rôle d’un gène ou d’une protéine, de tester des stratégies thérapeutiques et d’étudier la régulation de l’expression génique.

Compléments

• L’édition d’une région spécifique d’un gène peut altérer un domaine ou une fonction spécifique de la protéine, tandis que la modification de toute ou d’une grande partie de la séquence peut empêcher l’expression d’une version fonctionnelle de la protéine.

• L’édition de séquences régulatrices peut modifier le taux d’expression d’un gène, le type cellulaire, tissu ou organe où il s’exprime, ou le moment de son expression au cours du développement ou en réponse à d’autres signaux.

📖 2. Types de modifications génétiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Knock-out : Un knock-out (KO) correspond à l’invalidation d’un ou de plusieurs gènes par inactivation ou suppression.
• Knock-in : Un knock-in (KI) correspond à l’insertion d’une nouvelle séquence d’ADN à un locus précis où elle était absente, ou au remplacement d’une séquence initialement présente.
• Transgénique : Organisme dont le matériel génétique a été modifié par l’Homme.

📝 Points essentiels

• Les modifications permettant d’obtenir un KO ou un KI comprennent : la modification d’un ou de plusieurs nucléotides, la délétion d’une ou de plusieurs portions de séquence, l’insertion d’un fragment d’ADN neutre qui interrompt ou perturbe le gène

• Les KI peuvent notamment servir à introduire : des tags protéiques comme His ou FLAG, des gènes rapporteurs comme GFP, LacZ, la luciférase ou mCherry, des séquences permettant l’humanisation des modèles animaux, des modifications créant des modèles pathologiques

💡 Astuce mémo

KO : le gène est invalidé ; KI : une séquence est insérée ou remplace une séquence existante.

📖 3. Modulation de l’expression génique

🔑 Notions clés & Définitions

• Knock-down : Le knock-down (KD) est une réduction partielle de l’expression d’un gène.
• Surexpression : La surexpression est l’augmentation de l’expression d’un gène.

📝 Points essentiels

• L’interférence ARN, notamment par siRNA ou shRNA, peut réduire l’expression d’un gène sans éditer le génome.

• Le knock-down peut être obtenu par modification des séquences régulatrices du gène, notamment les promoteurs, les enhancers ou les silencers.

• La surexpression peut être obtenue par : l’ajout d’une ou de plusieurs copies supplémentaires du gène par KI, la modification des promoteurs, la modification des silencers, la modification des enhancers

💡 Astuce mémo

KD diminue l’expression ; la surexpression l’augmente.

📖 4. Réparation des cassures ciblées

🔑 Notions clés & Définitions

• HDR : La réparation dirigée par homologie (HDR), un sous-type de recombinaison homologue, utilise une matrice pour réparer une cassure double brin et permet une réparation fidèle et précise.

• NHEJ : La réparation par NHEJ (Non Homologous End Joining) répare une cassure double brin sans matrice, de manière aléatoire et non fidèle, et peut introduire de courtes insertions ou délétions appelées indels.

★ À maîtriser

• Les méthodes d’édition basées sur les nucléases génèrent une cassure double brin ciblée, puis la cellule la répare par HDR ou NHEJ, ce qui peut introduire des mutations au site de cassure.

Compléments

• Lors d’une édition par HDR, une séquence ADN donneuse contenant la modification souhaitée et flanquée de régions homologues à celles autour de la cassure peut servir de matrice de réparation à la place de la chromatide sœur.

• La HDR n’est possible que lorsque la cellule est en phase S ou G2 de son cycle cellulaire.

• La NHEJ est un mécanisme de réparation disponible à tout moment et constitue le mécanisme de réparation par défaut décrit pour la cassure double brin.

💡 Astuce mémo

HDR répare avec une matrice précise ; NHEJ répare sans matrice et peut créer des indels.

📖 5. Système CRISPR-Cas bactérien

🔑 Notions clés & Définitions

• CRISPR : CRISPR signifie Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats et désigne des séquences d’ADN répétées, palindromiques, courtes, régulièrement espacées et regroupées.
• Cas : Cas signifie CRISPR associated et désigne des protéines associées au système CRISPR.

★ À maîtriser

• L’ensemble des ARNcr spécifiques des bactériophages déjà rencontrés constitue une mémoire du système immunitaire bactérien.

• Les protéines Cas s’associent au crRNA pour reconnaître et couper l’ADN du bactériophage auquel celui-ci est spécifique et complémentaire.

• Lors d’infections suivantes par le même bactériophage, la bactérie exprime les protéines Cas et le crRNA spécifique, le système reconnaît et coupe le génome viral, puis le dégrade pour protéger la bactérie.

Compléments

• Les séquences répétées CRISPR mesurent 21 à 40 pb, tandis que les spacers mesurent 20 à 58 pb et correspondent à des séquences complémentaires de bactériophages ayant précédemment infecté la bactérie.

• 🔄 Lors d’une première infection : le bactériophage injecte son génome dans le cytoplasme bactérien, une protéine Cas coupe une séquence protospacer dans le génome viral, la séquence protospacer est intégrée au génome bactérien comme nouveau spacer

💡 Astuce mémo

Première infection : mémorisation en spacer ; infections suivantes : reconnaissance, coupure, dégradation.

📖 6. Découverte de CRISPR-Cas9

★ À maîtriser

• En 2012, Jennifer Doudna et Emmanuelle Charpentier synthétisent une chimère crRNA-tracrRNA appelée ARN guide.

Compléments

• En 2011, Emmanuelle Charpentier découvre le tracrRNA dans le cadre de la découverte du système CRISPR-Cas9 et de son utilisation pour l’édition des génomes.

• En 2020, Jennifer Doudna et Emmanuelle Charpentier reçoivent le prix Nobel de chimie.

📖 7. Application de CRISPR-Cas9 à l’édition

★ À maîtriser

• Pour éditer un ADN cible, un ARN guide associe un tracrRNA à un crRNA synthétique dont 20 nucléotides sont complémentaires d’un brin de l’ADN cible, puis se lie à Cas9 pour guider la coupure.

📌 La réparation NHEJ répare la cassure sans modèle et produit éventuellement des insertions ou délétions courtes aléatoires, tandis que la réparation HDR utilise un modèle pour permettre une édition précise.

Compléments

• La réparation HDR peut utiliser un modèle fourni par l’expérimentateur pour réaliser une édition précise de l’ADN.

• La réparation HDR est possible pendant les phases S et G2, lorsque les chromosomes possèdent deux chromatides sœurs, et avant l’anaphase de mitose.

💡 Astuce mémo

ARN guide → Cas9 → cassure de l’ADN cible

📖 8. Reconnaissance de la séquence PAM

🔑 Notions clés & Définitions

• PAM : Séquence d’ADN de 2 à 6 paires de bases située immédiatement après les 20 nucléotides reconnus par le crRNA et nécessaire à la reconnaissance et à la fixation de Cas9 sur l’ADN cible.

★ À maîtriser

📌 En l’absence de PAM compatible, Cas9 ne coupe pas l’ADN cible.

Compléments

• Le PAM de Cas9 de Streptococcus pyogenes est 5’-NGG-3’.

📌 Les chercheurs doivent choisir une cible d’ADN proche d’une séquence PAM compatible avec l’enzyme Cas9 utilisée.

📖 9. Atouts de CRISPR face aux nucléases

★ À maîtriser

📌 Les méganucléases nécessitent une nouvelle nucléase pour chaque ADN cible, et les ZFNs et TALENs une nouvelle paire de nucléases, alors que CRISPR repose sur Cas et un ARN guide modifiable.

• La conception d’un nouvel ARN guide est plus rapide et plus facile que celle d’une nouvelle paire de nucléases, ce qui explique la préférence pour CRISPR.

Compléments

• Dans CRISPR, le tracrRNA sert d’ARN charpente permettant la liaison du guide à la protéine Cas.

• Le crRNA est synthétisé pour reconnaître l’ADN cible et y amener Cas afin de permettre sa coupure.

💡 Astuce mémo

Nucléases classiques : nouvelle paire pour chaque cible ; CRISPR : nouvel ARN guide

📖 10. Variantes des outils CRISPR

★ À maîtriser

• Les éditeurs de bases à cytosine (CBEs) permettent la conversion C → T, tandis que les éditeurs de bases à adénine (ABEs) permettent la conversion A → G.

• Le prime editing utilise un pegRNA, un ARN guide modifié qui fournit la séquence de correction, et une nickase qui réalise une coupure simple brin.

Compléments

• Les méthodes citées comprennent :

  • base editing
  • prime editing
  • CRISPR-Cas12
  • CRISPR-Cas13

• L’édition épigénomique peut utiliser des protéines CRISPR ou d’autres protéines liées à des enzymes modifiant les méthylations de l’ADN ou les modifications des histones, afin de modifier le taux d’expression d’un gène.

📖 11. Recombinaison homologue et KO constitutifs

🔑 Notions clés & Définitions

• Recombinaison homologue : Échange ou remplacement de matériel génétique entre deux brins d’ADN comportant de longues séquences homologues, c’est-à-dire des séquences nucléotidiques similaires.
• Knock-out : Modèle animal ou cellulaire dans lequel un ou plusieurs gènes ont été inactivés ou enlevés.
• Knock-in : Modèle animal ou cellulaire dans lequel un ou plusieurs gènes ont été insérés ou substitués.

★ À maîtriser

• Un KO constitutif peut rendre une souris non viable si le gène inactivé est important pour le développement, ou masquer l’effet du gène dans un type cellulaire particulier.

Compléments

• Les scientifiques détournent la recombinaison homologue pour produire des KO ou des KI constitutifs, présents dans tout le corps.

• Chez les eucaryotes, la recombinaison homologue est notamment utilisée pendant la méiose pour générer de la diversité génétique par crossing-over.

💡 Astuce mémo

KO constitutif : toutes les cellules ; KO conditionnel : cellules ciblées ou moment choisi

📖 12. Recombinaison site-spécifique conditionnelle

🔑 Notions clés & Définitions

• Recombinase Cre : Enzyme qui excise, inverse ou transloque un fragment d’ADN situé entre deux sites LoxP.

★ À maîtriser

• Un KO conditionnel tissu-spécifique est obtenu en plaçant le gène de la recombinase sous le contrôle d’un promoteur spécifique du tissu ciblé, de sorte que Cre soit exprimée dans les cellules de ce tissu.

📌 Un KO tissu-spécifique restreint l’inactivation à certaines cellules, tandis qu’un KO inductible déclenche l’inactivation à partir du traitement par un inducteur.

Compléments

• Le promoteur du gène de l’insuline peut contrôler l’expression de Cre dans les cellules β-pancréatiques afin d’y induire un KO du gène cible floxé.

💡 Astuce mémo

Promoteur ciblé → Cre → recombinaison aux sites LoxP

📖 13. Systèmes inductibles de recombinaison

📝 Points essentiels

• Les systèmes inductibles cités sont Tet-On et Tet-Off, dont l’inducteur est la tétracycline ou la doxycycline, et Cre-ERt2, dont l’inducteur est le tamoxifène.