Fiche de révision : Modes et développement en HPLC

📋 Plan du Cours

1. Sécurité au laboratoire chromatographique
2. Fondements chromatographiques et isothermes de rétention
3. Chromatographie sur papier en pratique
4. Temps de rétention, temps mort et applications
5. Facteur de rétention et sélectivité chromatographique
6. Efficacité des colonnes et résolution des pics
7. Intégration et étalonnage en spectrophotométrie
8. Chromatographies selon la phase mobile
9. Chromatographie préparative, planaire et d’adsorption
10. Chromatographie de partage
11. Échange d’ions et exclusion stérique
12. Chromatographie d’affinité
13. Choix des mécanismes et des colonnes CPG
14. Détecteur à ionisation de flamme
15. TCD et spectrométrie de masse
16. Transestérification et contrôle par CCM
17. Pompes, réservoirs, injecteurs et colonnes HPLC
18. Détecteurs UV, DAD et spectrométrie de masse
19. Préparation des phases mobiles et HPLC normale et inverse
20. Élution isocratique, gradients et choix des phases mobiles
21. Développement et validation des méthodes HPLC
22. Principes de la CCM et choix des phases chromatographiques
23. Développement des plaques, révélation et facteur Rf
24. Échange d’ions, résines et purification des biomolécules
25. Exclusion stérique, masses molaires et choix du gel
26. Dessalage des protéines et manipulation de filtration sur gel

📖 1. Sécurité au laboratoire chromatographique

★ À maîtriser

📌 Au laboratoire, porter une blouse en coton, des lunettes et des gants adaptés, éviter toute flamme près des solvants inflammables, travailler sous hotte ou dans un local très aéré et ne jamais pipeter à la bouche.

Compléments

📌 Éviter le benzène, limiter les solvants chlorés aux cas sans substitut et les utiliser en petits volumes ; étiqueter les flacons, séparer les déchets halogénés et non halogénés et ne jamais verser de solvant organique à l’évier.

• Le méthanol est toxique par ingestion, inhalation et contact cutané, tandis que les acides, les bases et les réactifs de révélation nécessitent des gants et des lunettes.

📌 Les bouteilles de gaz comprimés doivent être stockées debout et arrimées ; l’hydrogène étant inflammable sur une large plage de concentration, les fuites doivent être détectées.

📖 2. Fondements chromatographiques et isothermes de rétention

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie : Méthode physico-chimique qui sépare les constituants d’un mélange par leur distribution différentielle entre une phase stationnaire et une phase mobile non miscibles.

★ À maîtriser

• La phase stationnaire est fixée dans une colonne ou sur une surface plane, tandis que la phase mobile, liquide, gazeuse ou supercritique, percole à travers elle et entraîne les solutés.

📐 Formule - Le coefficient de distribution est $K = \frac{C_s}{C_m}$, où $C_s$ et $C_m$ sont les concentrations du soluté dans les phases stationnaire et mobile.

• La séparation chromatographique résulte de la différence de distribution entre les phases, répétée au fil de nombreux équilibres le long de la colonne.

📌 Une isotherme linéaire, observée à faible concentration, correspond à un coefficient de distribution constant et produit un pic gaussien symétrique dont le temps de rétention ne dépend pas de la quantité injectée.

• À forte concentration, la saturation des sites produit une isotherme de Langmuir concave : les parties concentrées du pic migrent plus vite que les queues, donnant un front raide et une traînée (tailing).

📐 Formule - La hauteur équivalente à un plateau théorique vérifie l’équation de Van Deemter $H = A + \frac{B}{u} + C u$.

Compléments

• En 1903, Mikhaïl Tswett sépare des pigments foliaires sur une colonne de carbonate de calcium éluée à l’éther de pétrole et observe des bandes colorées.

📐 Formule - La vitesse de migration d’un soluté est $u_A = \frac{u}{1+k}$, avec $k = K\frac{V_s}{V_m} = \frac{K}{\beta}$ et $\beta = \frac{V_m}{V_s}$.

• Une isotherme anti-Langmuir convexe, plus rare et pouvant résulter de l’association du soluté dans la phase stationnaire, produit un fronting.

📌 En analyse, il faut rester dans le domaine linéaire pour obtenir des pics symétriques et une quantification fiable ; en chromatographie préparative, le régime non linéaire peut être utilisé volontairement.

• Le terme A représente la diffusion d’Eddy entre les grains du remplissage, est proportionnel au diamètre des particules et disparaît dans une colonne capillaire ouverte.

• Le terme B/u représente la diffusion longitudinale, dominante à faible vitesse ; la diffusion moléculaire est environ 10⁴ fois plus grande en phase gazeuse qu’en phase liquide.

• Le terme C·u représente la résistance au transfert de masse, augmente avec la vitesse et avec le carré du diamètre des particules ou de l’épaisseur du film.

📐 Formule - La vitesse optimale correspond à $u_{opt} = \sqrt{\frac{B}{C}}$, au minimum de la courbe de Van Deemter.

💡 Astuce mémo

Langmuir : traînée ; anti-Langmuir : fronting

📖 3. Chromatographie sur papier en pratique

★ À maîtriser

• En chromatographie sur papier, l’eau liée à la cellulose constitue le support de partage ; un solvant très polaire entraîne les colorants hydrophiles, tandis qu’un solvant plus organique entraîne les colorants moins polaires.

📐 Formule - Le rapport frontal est $Rf = \frac{d_S}{d_F}$, où $d_S$ est la distance entre la ligne de dépôt et le centre de la tache et $d_F$ la distance entre le dépôt et le front du solvant.

Compléments

• Pour développer un chromatogramme sur papier, tracer la ligne de dépôt au crayon, déposer et sécher les échantillons, saturer la cuve fermée en vapeurs de solvant pendant 5 minutes, puis placer la bande sans immerger la ligne de dépôt.

• Retirer la bande lorsque le front du solvant atteint 1 cm du haut, marquer immédiatement le front, laisser sécher, mesurer les distances de migration des taches et du front, puis répéter avec un second solvant pour comparer les résultats.

• Dans un solvant donné, les composants d’un échantillon ont des Rf reproductibles, mais les Rf changent avec le solvant, ce qui modifie la sélectivité.

💡 Astuce mémo

Déposer, développer, marquer le front, mesurer, calculer Rf

📖 4. Temps de rétention, temps mort et applications

🔑 Notions clés & Définitions

• Temps de rétention : Temps écoulé entre l’injection et l’apparition du maximum du pic du soluté au détecteur.
• Temps mort : Temps de passage dans la colonne d’un composé non retenu par la phase stationnaire, pour lequel k = 0 ; il correspond au temps de séjour de la phase mobile.
• Temps de rétention réduit : Le temps de rétention réduit t'R est le temps de rétention corrigé du temps mort : $t'_R = t_R - t_M$.

★ À maîtriser

📐 Formule - Le temps mort vérifie $t_M = \frac{L}{u} = \frac{V_M}{F}$.

• Un temps mort anormal peut révéler un volume mort extra-colonne ou un débit erroné, et le temps mort sert aussi à calculer le facteur de rétention et à estimer le volume total de la colonne.

Compléments

📐 Formule - Le volume de rétention est $V_R = t_R F$, où $F$ est le débit volumique de la phase mobile.

• À conditions opératoires fixées, le temps de rétention est caractéristique du soluté et permet son identification par comparaison avec un témoin.

• Le temps de rétention varie avec :

  • les phases stationnaire et mobile
  • la température
  • le débit
  • les dimensions de la colonne
  • la surcharge
  • le vieillissement de la colonne
  • les fuites
  • une dérive de composition de la phase mobile

📐 Formule - Pour un système sans pertes de charge excessives, le temps de rétention varie en $\frac{1}{F}$ avec le débit volumique et est proportionnel à la longueur de colonne $L$.

• En HPLC en phase inverse, le temps mort peut être déterminé par injection d’uracile ou de thiourée en détection UV, de nitrate de sodium ou d’un excès de solvant organique en détection RI.

• En HPLC en phase normale, le toluène ou le tri-tert-butylbenzène peuvent servir à déterminer le temps mort, tandis qu’en CPG on peut utiliser le méthane avec un détecteur FID, ou l’air et l’argon avec un détecteur TCD.

📐 Formule - Le volume mort d’une colonne remplie peut être estimé par $V_M \approx \varepsilon_T \pi r^2 L$, avec une porosité totale $\varepsilon_T$ de 0,6 à 0,7 pour les colonnes HPLC remplies.

• Pour une colonne HPLC de 150 × 4,6 mm, le volume géométrique est d’environ 2,49 mL et, avec une porosité totale de 0,65, le volume mobile est d’environ 1,6 mL, soit un temps mort d’environ 1,6 min à 1,0 mL/min.

📌 Le pic de solvant ne doit pas être confondu avec un pic de soluté, et le volume mort extra-colonne doit rester très inférieur à la largeur des pics, surtout en UHPLC.

💡 Astuce mémo

tR décrit l’élution d’un soluté retenu ; tM celle d’un composé non retenu

📖 5. Facteur de rétention et sélectivité chromatographique

🔑 Notions clés & Définitions

• Facteur de rétention : Le facteur de rétention, aussi appelé facteur de capacité ou autrefois k', est le rapport à l’équilibre des quantités de soluté dans les phases stationnaire et mobile, soit $k = n_s/n_m = K V_s/V_m = (t_R - t_M)/t_M = t'_R/t_M$.
• Sélectivité : La sélectivité, ou facteur de séparation, est le rapport entre les facteurs de rétention de deux solutés, soit $\alpha = k_2/k_1 = K_2/K_1 = t'_{R2}/t'_{R1}$, avec par convention α ≥ 1.

★ À maîtriser

📐 Formule - Le temps de rétention vérifie $t_R = t_M(1+k)$.

📌 Le facteur de rétention idéal se situe entre 2 et 10, ou entre 1 et 5 pour une analyse rapide en HPLC ; en dessous de 1, le soluté sort avec le front, tandis qu’au-delà de 10 à 20, l’analyse s’allonge et les pics s’élargissent.

📌 Si α = 1, deux pics ont la même rétention et leur séparation est impossible, quelle que soit l’efficacité de la colonne.

• La sélectivité est le levier le plus puissant de la résolution : passer de α = 1,05 à α = 1,10 divise par plus de trois le nombre de plateaux nécessaires.

Compléments

• Le facteur de rétention est indépendant du débit et de la longueur de la colonne.

• Le facteur de rétention varie avec : la force éluante de la phase mobile, le pH et l’ionisation des solutés, la température, la nature et le taux de greffage de la phase stationnaire, le rapport de phase β = Vm/Vs

📌 En phase inverse, diminuer de 10 % la teneur en solvant organique multiplie empiriquement k par 2 à 3, selon la « règle de 3 ».

📐 Formule - En CCM, $R_f = 1/(1+k)$, donc $k = (1-R_f)/R_f$ ; un spot de Rf = 0,25 correspond à k = 3.

• La sélectivité dépend de la chimie du système — phase stationnaire, phase mobile, température et pH — et non de la géométrie de la colonne.

• La sélectivité peut être modifiée par :

  • la phase stationnaire
  • le solvant organique
  • le pH
  • la force ionique
  • les additifs, notamment les paires d’ions
  • la température

📖 6. Efficacité des colonnes et résolution des pics

🔑 Notions clés & Définitions

• Hauteur équivalente à un plateau théorique : La hauteur équivalente à un plateau théorique H est la longueur de colonne correspondant à un plateau et vérifie $H = L/N$ ; plus H est petite, plus la colonne est efficace.
• Résolution : La résolution Rs mesure la séparation de deux pics et se calcule par $R_s = 2(t_{R2}-t_{R1})/(w_1+w_2) = 1{,}18(t_{R2}-t_{R1})/(w_{1/2{,}1}+w_{1/2{,}2})$.
• Nombre de plateaux théoriques : Le nombre de plateaux théoriques N est le nombre de tranches fictives de la colonne dans lesquelles l’équilibre est atteint, selon la théorie des plateaux de Martin et Synge.

★ À maîtriser

📐 Formule - Pour un pic gaussien, $N = 16(t_R/w)^2 = 5{,}54(t_R/w_{1/2})^2$, où w est la largeur à la base et w½ la largeur à mi-hauteur.

📌 Une résolution Rs = 1,0 correspond à une séparation d’environ 98 % avec 2 % de recouvrement, tandis que Rs ≥ 1,5 correspond à une séparation à la ligne de base d’environ 99,7 %.

📐 Formule - La résolution fondamentale vérifie $R_s = (\sqrt{N}/4)((\alpha-1)/\alpha)(k/(1+k))$, où k est celui du second pic.

Compléments

• Pour un pic dissymétrique, la Pharmacopée utilise le calcul de N fondé sur la largeur à mi-hauteur.

• N dépend du soluté, croît avec k jusqu’à un palier et se calcule de préférence sur un soluté retenu, avec k > 2.

• L’efficacité augmente avec des particules plus fines et un meilleur remplissage, et dépend aussi de la longueur de colonne, du débit relatif à uopt, de la viscosité, de la température, de la diffusion, des volumes morts, du volume injecté et de la force du solvant d’injection.

• N est un critère d’aptitude du système : sa diminution peut signaler le vieillissement de la colonne ou un problème de raccord, et un pic plus étroit est plus facile à distinguer du bruit à masse injectée constante.

📐 Formule - La hauteur réduite vérifie $h = H/d_p$ ; une colonne HPLC bien remplie présente h ≈ 2 à 3 à son optimum.

• L’équation de Van Deemter décrit H par les termes A, B/u et C·u, associés respectivement à la granulométrie et au remplissage, à la diffusion axiale et au transfert de masse.

• En colonne capillaire, l’équation de Golay $H = B/u + (C_s + C_m)u$ remplace l’équation de Van Deemter, car A = 0.

📌 Les méthodes validées visent généralement Rs ≥ 2 entre le principe actif et l’impureté la plus proche afin de garantir la robustesse.

• La résolution dépend de l’efficacité √N, de la sélectivité (α − 1)/α et de la rétention k/(1 + k), et varie comme √N puis comme √L.

• Doubler Rs en augmentant uniquement la longueur exige de quadrupler la longueur de colonne et le temps d’analyse.

📖 7. Intégration et étalonnage en spectrophotométrie

★ À maîtriser

• Pour intégrer manuellement un chromatogramme, on découpe chaque pic de la ligne de base au sommet, on effectue au moins 3 pesées par pic et on calcule son aire relative en divisant sa masse par la masse totale des pics.

• Pour doser une solution inconnue par étalonnage, on prépare 5 solutions étalon, on mesure leur absorbance à 427 nm pour la tartrazine, on trace la droite $A=f(C)$, puis on utilise cette droite pour déterminer la concentration de l’inconnue.

Compléments

📐 Formule - Pour un pic triangulaire, l’aire estimée est $A = h \times w_{1/2}$, où la hauteur et la largeur à mi-hauteur sont mesurées à la règle.

• Pour des pics symétriques, les aires obtenues par pesée et par triangulation doivent concorder à mieux que 5 à 10 %.

• Les résultats attendus de l’étalonnage comprennent une droite avec $r^2>0{,}99$ et une concentration de l’inconnue accompagnée de son incertitude.

• La limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ) sont estimées à partir de l’écart-type des résidus de la droite d’étalonnage.

📖 8. Chromatographies selon la phase mobile

★ À maîtriser

📌 La CPL utilise une phase mobile liquide et convient aux solutés dissous qui n’ont pas besoin d’être volatils ni thermiquement stables, tandis que la CPG utilise un gaz inerte et exige des composés volatils et thermiquement stables ou dérivatisés.

• La CPL couvre notamment les principes actifs polaires, ionisables, de masse molaire élevée ou thermolabiles, ainsi que les impuretés, produits de dégradation, vitamines et échantillons de bioanalyse ; elle représente plus de 80 % des analyses pharmaceutiques actuelles.

• Pour le CO₂ supercritique, la température critique est de 31,1 °C et la pression critique de 73,8 bar (7,38 MPa).

Compléments

• La CLHP fonctionne à environ 400 bar et l’UHPLC peut atteindre 1000 bar ou plus avec des particules inférieures à 2 μm.

• En CPG, les gaz vecteurs inertes cités sont l’hélium, l’hydrogène et l’azote, et la séparation dépend des interactions entre le soluté et la phase stationnaire ainsi que de la volatilité des solutés.

• En CPG, le FID détecte les composés organiques, le TCD est universel et non destructif, l’ECD cible les composés halogénés, le NPD ou FTD l’azote et le phosphore, le FPD le soufre et le phosphore, et la MS contribue à l’identification.

• Un fluide supercritique associe une masse volumique proche de celle d’un liquide à une viscosité proche de celle d’un gaz et à des coefficients de diffusion supérieurs à ceux de la phase liquide, ce qui favorise de bonnes efficacités à fort débit avec de faibles pertes de charge.

• La CPS est particulièrement adaptée aux séparations rapides d’énantiomères, aux composés peu ou moyennement polaires, aux lipides, aux produits naturels et aux triglycérides, avec une faible consommation de solvants organiques toxiques et une évaporation facile en préparatif.

• En CPS, une pompe refroidie fournit le CO₂ liquide, une pompe ajoute le cosolvant (méthanol, éthanol) à 2 à 40 %, et un régulateur de contre-pression maintient la pression au-dessus de la pression critique jusqu’à la sortie du détecteur.

💡 Astuce mémo

Gaz vecteur en CPG : pas de rôle sélectif ; solvant liquide en CPL : paramètre majeur.

📖 9. Chromatographie préparative, planaire et d’adsorption

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie d’adsorption : La chromatographie d’adsorption sépare les solutés selon leur adsorption à la surface d’un solide polaire, notamment la silice, l’alumine ou le florisil, par des liaisons hydrogène et des interactions dipolaires avec les groupements de surface.
• Chromatographie sur papier : La chromatographie sur papier utilise l’eau fixée sur la cellulose comme phase stationnaire et repose sur un mécanisme de partage.
• Chromatographie sur couche mince : La chromatographie sur couche mince utilise principalement l’adsorption lorsque la phase stationnaire est de la silice.

★ À maîtriser

• 🔄 La séparation sur colonne suit ces étapes :
  1. Déposer l’échantillon en bande étroite.
  2. Éluer la colonne.
  3. Recueillir des fractions.
  4. Contrôler la composition des fractions.
  5. Réunir les fractions de même composition et évaporer le solvant.

📌 La masse de silice utilisée est généralement de 30 à 100 fois la masse de l’échantillon et peut atteindre 200 à 500 fois cette masse pour les séparations difficiles.

📐 Formule - Le facteur de rétention est défini par $Rf=\frac{dS}{dF}$, où dS est la distance entre la ligne de dépôt et le centre de la tache et dF la distance entre la ligne de dépôt et le front du solvant.

• Le Rf est compris entre 0 et 1 ; la plage recherchée est de 0,2 à 0,8 en analyse et de 0,2 à 0,35 pour choisir l’éluant d’une colonne.

📌 La chromatographie sur colonne sert surtout à la préparation et à la purification, tandis que la chromatographie planaire sert surtout à l’analyse rapide et à orienter une purification.

• Dans la chromatographie d’adsorption, la phase mobile entre en compétition avec les solutés pour les sites actifs de l’adsorbant, et un éluant plus polaire déplace davantage les solutés.

• La série éluotropique de Snyder classe les solvants selon leur force éluante ε° par rapport à l’alumine : hexane 0,01 ; toluène 0,29 ; dichlorométhane 0,42 ; éther diéthylique 0,38 ; THF 0,45 ; acétate d’éthyle 0,58 ; acétone 0,56 ; acétonitrile 0,65 ; propan-2-ol 0,82 ; méthanol 0,95.

• Sur silice, l’ordre d’élution approximatif, du premier au dernier, est : alcanes, alcènes, aromatiques, halogénures, éthers, esters, cétones, aldéhydes, amines, alcools, phénols et acides.

Compléments

📌 Pour préparer une colonne, on la maintient verticale, on vise une hauteur de lit d’environ 10 fois son diamètre et on ne laisse jamais le niveau du solvant descendre sous le haut du lit.

• La voie humide, où la phase stationnaire est mise en suspension dans l’éluant initial, donne un remplissage plus homogène et sans bulles d’air que la voie sèche.

📌 L’éluant d’une colonne est choisi par CCM sur plaque de silice en visant un Rf d’environ 0,2 à 0,35 pour le composé cible.

• En 1978, Still développe la chromatographie flash, où l’élution est réalisée sous pression d’air ou d’azote.

• La chromatographie planaire est rapide, peu coûteuse et permet d’analyser plusieurs échantillons sur une même plaque, mais son efficacité est inférieure à celle de la HPLC et la reproductibilité du Rf dépend de l’humidité, de la température et de la saturation.

💡 Astuce mémo

Éluant plus polaire → déplacement accru des solutés adsorbés.

📖 10. Chromatographie de partage

🔑 Notions clés & Définitions

• HILIC : La HILIC est un mode de partage utilisant une phase stationnaire polaire et une phase mobile riche en acétonitrile (> 70 %) contenant un peu d’eau ; un film d’eau enrichi à la surface stationnaire permet de séparer des solutés très polaires.

★ À maîtriser

📌 En phase normale, la phase stationnaire est polaire et la phase mobile apolaire ; en phase inverse, la phase stationnaire est apolaire (C18, C8 ou phényle) et la phase mobile polaire, généralement eau et méthanol ou acétonitrile.

• En phase inverse, pour un composé neutre, log k augmente avec l’hydrophobie (log P), et chaque groupement méthylène augmente le facteur de rétention d’environ 1,5 à 2 fois.

Compléments

• La HILIC permet notamment de séparer les sucres, les aminoacides et les nucléosides.

• La chromatographie de partage sert notamment au dosage de médicaments, vitamines, antibiotiques et acides aminés après dérivatisation, à l’analyse de composés comme le paracétamol et la caféine, ainsi qu’à la séparation de sucres en HILIC et de triglycérides.

• En phase inverse, la rétention dépend notamment de la nature et de la longueur de la chaîne greffée, avec l’ordre C18 > C8 > C4, de la densité de greffage et du blocage des silanols résiduels par end-capping.

💡 Astuce mémo

En phase normale, la stationnaire est polaire ; en phase inverse, elle est apolaire.

📖 11. Échange d’ions et exclusion stérique

🔑 Notions clés & Définitions

• Coefficient Kd : Le coefficient Kd de l’exclusion stérique est défini par $K_d = \frac{V_e - V_0}{V_t - V_0}$ et varie de 0, pour une exclusion totale, à 1, pour une pénétration totale dans les pores.

★ À maîtriser

• En échange d’ions, des solutés de charge opposée à celle des groupements fixes de la phase stationnaire remplacent réversiblement les contre-ions mobiles ; l’élution s’effectue en augmentant la force ionique ou en modifiant le pH.

• En exclusion stérique, les grosses molécules exclues des pores d’un gel sont éluées les premières au volume mort V0, tandis que les petites molécules pénètrent dans les pores, suivent un trajet plus long et sont éluées plus tard, au plus tard au volume total Vt.

Compléments

• La rétention en échange d’ions dépend de la charge et de la densité de charge du soluté, ainsi que de la nature et de la concentration du contre-ion de la phase mobile.

• Les échangeurs de cations forts portent des sulfonates (SCX) et sont utilisables de pH 1 à 14, tandis que les échangeurs faibles portent des carboxylates (WCX) et sont actifs au-dessus de pH 4–5.

• Les échangeurs d’anions forts portent des ammoniums quaternaires (SAX ou Q), tandis que les échangeurs faibles portent des amines tertiaires de type DEAE, actives en dessous de pH 9–10.

• L’échange d’ions sert au dessalage et à la déminéralisation de l’eau, au dosage des ions et acides organiques, ainsi qu’à la séparation ou purification d’acides aminés, protéines, peptides, acides nucléiques, vaccins, aminoglycosides et catécholamines.

• L’exclusion stérique vise à séparer les molécules selon leur volume hydrodynamique sans interaction chimique souhaitée avec la phase stationnaire poreuse.

• La gel-filtration sert au dessalage et au changement de tampon des protéines, à l’estimation des masses molaires, à la détermination de leur distribution en GPC organique et à la détection d’agrégats ou de fragments protéiques.

• En fractionnement par exclusion stérique, le volume d’échantillon est limité à 2–5 % du volume de lit, tandis qu’il peut atteindre 30 % en dessalage.

• Pour choisir une colonne d’exclusion, le domaine de fractionnement du gel doit encadrer les masses molaires à séparer ; les exemples indiqués sont Sephadex G-25 pour le dessalage (limite d’exclusion d’environ 5 000 Da), Sephadex G-50 ou Bio-Gel P-30 pour les peptides, Sephacryl S-200 ou Superdex 200 pour les protéines de 10 à 600 kDa, et Styragel pour la GPC organique.

💡 Astuce mémo

L’échange trie les charges ; l’exclusion trie les volumes.

📖 12. Chromatographie d’affinité

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie d’affinité : La chromatographie d’affinité utilise un ligand biospécifique fixé de façon covalente sur une matrice inerte ; la molécule cible qui reconnaît ce ligand est retenue, tandis que les autres composés sont éliminés au lavage.

★ À maîtriser

• La purification par affinité suit cinq étapes : équilibrage de la colonne, chargement de l’échantillon, lavage des composés non liés, élution de la cible, puis régénération et conservation de la colonne.

Compléments

• La reconnaissance du ligand en chromatographie d’affinité repose sur une complémentarité de forme et des interactions multiples, avec des constantes d’affinité de 10−5 à 10−12 M.

• Les couples d’affinité cités sont :

  • antigène–anticorps
  • enzyme–substrat ou inhibiteur
  • lectine–sucre
  • biotine–streptavidine
  • protéine poly-histidine–ion nickel (IMAC)
  • protéine A/G–immunoglobuline G
  • glutathion–GST

• L’élution par compétition peut utiliser de l’imidazole à 100–300 mM pour une protéine His-tag ou du sucre libre pour une lectine ; une variation de pH peut utiliser la glycine-HCl à pH 2,5–3.

• La chromatographie d’affinité permet notamment de purifier des protéines recombinantes, anticorps monoclonaux, enzymes, hormones, glycoprotéines et plasmides, d’éliminer des protéines abondantes du sérum et d’analyser des interactions.

• L’affinité offre une forte sélectivité et peut multiplier la purification par plusieurs centaines en une étape, mais le ligand peut être coûteux, fragile ou lixiviable, la capacité est limitée et l’élution peut dénaturer la cible.

💡 Astuce mémo

Équilibrer → charger → laver → éluer → régénérer.

📖 13. Choix des mécanismes et des colonnes CPG

★ À maîtriser

• Le mécanisme chromatographique se choisit selon l’analyte : les composés apolaires relèvent de la phase normale ou inverse, les polaires neutres de la phase inverse ou de la HILIC, les composés ioniques de l’échange d’ions ou de la phase inverse avec contrôle du pH, et les macromolécules de l’exclusion ou de l’affinité.

• En phase inverse, le composé le plus hydrophobe est élué en dernier, tandis qu’en phase normale c’est le composé le plus polaire qui est élué en dernier.

• Les colonnes capillaires sont préférées dans presque toutes les analyses grâce à leur haute résolution, leur rapidité, leur faible consommation de phase et de gaz, et leur couplage facile à la spectrométrie de masse.

• Selon le principe « semblable dissout semblable », les analytes apolaires sont séparés sur une phase apolaire et les analytes polaires sur une phase polaire.

• Un diamètre de colonne plus étroit augmente le nombre de plateaux mais réduit la capacité, tandis qu’un film épais augmente le facteur de rétention des composés très volatils et qu’un film mince réduit le temps d’analyse des composés peu volatils.

Compléments

• En CCM sur silice, augmenter la polarité de l’éluant augmente les Rf et réduit la sélectivité entre colorants ; avec l’éthanol utilisé comme éluant D, tous les composés migrent près du front.

• En chromatographie sur papier avec butanol, acide acétique et eau, la leucine hydrophobe migre davantage que la glycine, tandis que l’acide aspartique et la lysine, polaires ou chargés, restent plus bas.

• Les colonnes capillaires de CPG ont une efficacité de 3 000 à 5 000 plateaux par mètre, contre environ 2 000 à 5 000 plateaux pour une colonne remplie.

• Les colonnes remplies ont une grande capacité, sont robustes et conviennent aux gaz permanents, aux grandes quantités ou à la préparation ; les colonnes capillaires sont préférées pour la plupart des analyses en raison de leur haute résolution, de leur rapidité et de leur facilité de couplage à la spectrométrie de masse.

• Les phases stationnaires de CPG décrites comprennent : le PDMS apolaire (DB-1, HP-1), le 5 % phényl-PDMS faiblement polaire (DB-5), le 14 % cyanopropylphényl moyennement polaire (DB-1701), le polyéthylèneglycol polaire (WAX), le cyanopropylpolysiloxane de type CP-Sil 88

• Les phases DB-1 et HP-1 conviennent aux hydrocarbures, solvants et huiles essentielles ; DB-5 à des analyses générales d’arômes, stupéfiants, pesticides et solvants ; DB-1701 aux pesticides et solvants résiduels ; WAX aux alcools, acides gras libres, arômes et éthanol sanguin ; CP-Sil 88 aux FAME cis/trans.

• La phase cyanopropylpolysiloxane à teneur élevée en cyanopropyle est très polaire, supporte 240–250 °C et convient aux séparations cis/trans des FAME.

• Les phases dérivées de β-cyclodextrine sont chirales, supportent 220–250 °C et servent à séparer les énantiomères volatils.

• Les colonnes remplies restent avantageuses pour analyser les gaz permanents, traiter de grandes quantités ou effectuer une préparation.

• En colonne capillaire, l’absence du terme A dans l’équation de Van Deemter permet d’obtenir l’efficacité maximale selon l’équation de Golay.

• Pour des analytes apolaires sur une phase apolaire, l’élution suit l’ordre des points d’ébullition.

💡 Astuce mémo

En NP, le plus polaire sort dernier ; en RP, c’est le plus hydrophobe.

📖 14. Détecteur à ionisation de flamme

★ À maîtriser

• 🔄 Le signal du FID est produit par les étapes suivantes :

  1. L’effluent de la colonne est mélangé à l’hydrogène.
  2. Le mélange est brûlé dans l’air au bout d’un brûleur.
  3. La combustion des composés organiques forme des ions CHO⁺ et des électrons.
  4. Une tension entre le brûleur et l’électrode collectrice produit un courant amplifié en signal.

• Le courant du FID est proportionnel au nombre d’atomes de carbone efficaces, liés à H ou à C, qui brûlent par seconde; le FID est donc un détecteur de débit massique.

• Le FID présente une sensibilité d’environ 10 pg de carbone par seconde, un domaine linéaire d’environ 10⁷, une grande robustesse, un faible bruit, une réponse quasi universelle aux composés organiques et une relative insensibilité aux fluctuations de débit.

Compléments

• La tension de polarisation du FID est de 150 à 300 V et le courant produit est de l’ordre du pA au nA.

📌 Le FID détruit l’échantillon et répond peu ou pas à H₂O, CO, CO₂, CS₂, N₂, aux gaz rares et à l’acide formique; sa réponse est faible pour les composés très oxygénés ou halogénés.

• Le FID nécessite de l’hydrogène, de l’air et un gaz auxiliaire; l’hydrogène est inflammable.

• Pour un FID associé à une colonne capillaire, les débits typiques sont de 30–40 mL/min pour H₂, de 300–450 mL/min pour l’air et de 25–30 mL/min pour le gaz auxiliaire N₂ ou He.

📌 La température du FID doit dépasser d’au moins 20 °C celle du four et atteindre au minimum 150 °C pour éviter la condensation d’eau.

• Les principales applications du FID comprennent :
  • les hydrocarbures
  • les huiles essentielles
  • les esters méthyliques d’acides gras
  • les solvants résiduels
  • l’éthanol et les alcools de l’alcoolémie
  • les médicaments volatils
  • les pesticides organiques

📖 15. TCD et spectrométrie de masse

★ À maîtriser

• Dans un TCD, deux filaments chauffés en tungstène-rhénium et deux résistances fixes forment un pont de Wheatstone; un filament est balayé par le gaz vecteur pur et l’autre par l’effluent, dont la conductivité thermique modifie la température et la résistance du filament de mesure, déséquilibrant le pont et produisant un signal.

• Le TCD est un détecteur universel, non destructif et sensible à la concentration; il répond notamment aux gaz permanents, à l’eau et aux composés inorganiques, et peut être monté en série avant un FID.

• En GC-MS, les solutés élués sont ionisés, fragmentés puis analysés selon leur rapport m/z; l’ionisation électronique à 70 eV produit un ion moléculaire M⁺

• et des fragments reproductibles, tandis que l’ionisation chimique, plus douce, favorise l’ion moléculaire protoné [M+H]⁺.

• Le balayage complet (scan), par exemple de m/z 35 à 550, sert à l’identification, tandis que le suivi d’ions sélectionnés (SIM) sert à quantifier des traces.

• Pour les huiles essentielles, l’identification par spectre de masse et similarité se combine avec l’indice de rétention de Kováts; l’indice se calcule en isotherme à partir des logarithmes des temps de rétention réduits des alcanes encadrants, et en programmation linéaire de température à partir des temps de rétention.

Compléments

• La sensibilité du TCD est environ 10³ fois inférieure à celle du FID, soit de l’ordre du ng; le TCD est sensible aux variations de débit et de température, et son filament fragile ne doit jamais être chauffé sans gaz vecteur.

📌 Pour obtenir un signal important en TCD, on choisit l’hélium ou l’hydrogène comme gaz vecteur, car leurs conductivités thermiques sont respectivement d’environ 0,15 et 0,18 W·m⁻¹·K⁻¹ à 300 K, contre 0,026 W·m⁻¹·K⁻¹ pour N₂.

• Les précautions d’optimisation du TCD sont : thermostater le bloc détecteur de façon stable, limiter le courant du filament à la valeur nécessaire, éviter l’oxygène à haute température

• Le TCD sert notamment à analyser les gaz permanents H₂, O₂, N₂, CO et CO₂ sur tamis moléculaire ou Porapak, ainsi que les gaz médicaux et respiratoires, l’eau par GC après Karl Fischer, la pureté des solvants et les composés organiques à forte concentration.

• En ionisation électronique, le spectre de masse forme une empreinte digitale comparable aux bibliothèques NIST et Wiley.

• Un système GC-MS comprend une ligne de transfert chauffée à 250–300 °C, une source EI à 70 eV chauffée à environ 230 °C, un analyseur, un multiplicateur d’électrons, un vide de 10⁻⁵ à 10⁻⁶ Torr, ainsi qu’un système de données et des bibliothèques.

• Les analyseurs GC-MS comprennent le quadripôle simple, le triple quadripôle, le piège d’ions, le temps de vol (TOF) et l’Orbitrap; le quadripôle simple est le plus courant.

• La GC-MS permet notamment d’identifier les constituants d’huiles essentielles et d’extraits de plantes, les solvants résiduels et impuretés volatiles, les stupéfiants et produits dopants, les substances en toxicologie analytique, les acides gras, stéroïdes et métabolites après dérivatisation, les pesticides et les contaminants environnementaux.

📌 La GC-MS offre sélectivité, identification, sensibilité de l’ordre du pg en SIM et accès aux bibliothèques, mais elle coûte cher, demande maintenance et vide, se limite aux composés volatils et thermostables, peut ne pas distinguer des isomères de position sur le seul spectre et expose la source à la contamination.

📐 Formule - En isotherme, l’indice de Kováts est $I = 100\left[n + \frac{\log t'_R(x)-\log t'_R(n)}{\log t'_R(n+1)-\log t'_R(n)}\right]$.

📐 Formule - En programmation linéaire de température, l’indice de rétention est $I = 100\left[n + \frac{t_R(x)-t_R(n)}{t_R(n+1)-t_R(n)}\right]$.

💡 Astuce mémo

TCD : réponse universelle non destructive ; MS : identification sélective

📖 16. Transestérification et contrôle par CCM

★ À maîtriser

• 🔄 La transestérification se réalise dans l’ordre suivant :

  1. Dissoudre 100 mg d’huile dans 2 mL d’hexane.
  2. Ajouter 0,2 mL de KOH méthanolique à 2 mol/L.
  3. Boucher et agiter vigoureusement 30 s.
  4. Laisser décanter 5 min.
  5. Prélever la phase supérieure hexanique contenant les esters méthyliques.
  6. Neutraliser avec une pointe de NaHSO₄ et laisser clarifier.

• 🔄 Le contrôle par CCM suit les étapes suivantes :

  1. Déposer l’huile dans l’hexane et la phase hexanique après réaction, avec éventuellement de l’acide oléique.
  2. Développer la plaque dans l’éluant.
  3. Sécher la plaque.
  4. Révéler à l’iode.
  5. Mesurer les Rf.

• Après transestérification, la tache des triglycérides disparaît ou diminue fortement et une nouvelle tache de Rf plus élevé, correspondant aux esters méthyliques, apparaît près du front.

Compléments

📌 L’iode est toxique et corrosif et doit être manipulé sous hotte ou dans un espace ventilé ; les déchets organiques halogénés et non halogénés sont collectés dans des bidons séparés.

📐 Formule - Pour une colonne de 30 m, le temps mort est $t_M = L/u$ ; avec une vitesse linéaire optimale d’environ 21 cm/s, $t_M = 3\,000\ \mathrm{cm}/(21\ \mathrm{cm\,s^{-1}}) \approx 143\ \mathrm{s} \approx 2{,}4\ \mathrm{min}$.

📖 17. Pompes, réservoirs, injecteurs et colonnes HPLC

★ À maîtriser

• Les gaz dissous peuvent former des bulles lors d’une chute de pression ou du mélange eau-solvant organique ; ils provoquent une dérive et des pics parasites de la ligne de base, une cavitation de la pompe, un débit erratique et une baisse de l’absorbance détectée.

• Une pompe HPLC délivre un débit constant sans pulsations, généralement de 0,01 à 10 mL/min en analytique ; les pressions maximales sont de 400 bar en HPLC conventionnelle et de 1 000 à 1 500 bar en UHPLC.

📌 Une pompe isocratique maintient une composition constante de phase mobile et convient aux analyses de routine d’un produit, tandis qu’une pompe à gradient fait varier la composition pour les analyses complexes ou le développement de méthode.

• Un injecteur à boucle à six voies possède une position de chargement, où l’échantillon remplit la boucle tandis que la phase mobile la contourne, et une position d’injection, où la boucle rejoint le circuit et la phase mobile entraîne l’échantillon vers la colonne.

📌 Le solvant de l’échantillon doit avoir une force éluante inférieure ou égale à celle de la phase mobile, sinon les pics peuvent être déformés ou dédoublés.

• Les chaînes greffées courantes sur silice comprennent :
  • C18
  • C8
  • phényle
  • cyanopropyle
  • aminopropyle
  • diol

📐 Formule - La perte de charge suit la relation $\Delta P \propto \frac{\eta L F}{d_p^2 d_c^2}$, où elle augmente avec la viscosité, la longueur et le débit, et diminue avec le carré du diamètre des particules et celui du diamètre interne.

Compléments

• Les réservoirs HPLC sont des flacons de verre de 0,5 à 2 L munis d’un tube plongeur avec frittée d’entrée de 10 μm ; les solvants sont de qualité HPLC ou LC-MS et l’eau est ultrapure, de résistivité 18,2 MΩ·cm.

📌 Les phases aqueuses et tampons sont filtrés sur membrane de 0,45 μm, ou de 0,22 μm en UHPLC, et renouvelés régulièrement, car les tampons sans solvant organique peuvent être contaminés en quelques jours.

• L’oxygène dissous absorbe dans l’UV en dessous de 220 nm et éteint la fluorescence.

• Le dégazage HPLC peut être effectué en ligne sous vide, par barbotage d’hélium pendant 10 min à 30–60 mL/min, ou par ultrasons pendant 10 à 15 min et filtration sous vide, cette dernière solution ayant un effet temporaire de quelques heures.

📌 Les frittées d’entrée ne doivent ni sécher ni se colmater, et les solvants incompatibles ne doivent pas être mélangés sans rinçage ; ainsi, des tampons mélangés à 100 % d’acétonitrile peuvent précipiter.

📌 Le gradient basse pression mélange 2 à 4 solvants avant une seule pompe et présente un volume de retard de 0,5 à 1,5 mL, tandis que le gradient haute pression mélange après des pompes séparées et présente un volume de retard de 0,1 à 0,5 mL.

📐 Formule - Le retard du gradient vérifie $t_{\mathrm{retard}} = V_{\mathrm{retard}}/F$ ; par exemple, 1,2 mL à 0,6 mL/min donnent un retard de 2,0 min.

📌 En remplissage complet, le volume injecté est déterminé par la boucle, remplie avec un excès de 3 à 5 fois son volume, avec une précision de ±0,5 % ; en remplissage partiel, il est déterminé par la seringue, qui ne doit pas utiliser plus de 50 % du volume de la boucle, avec une précision de ±1 à 2 %.

📌 Le volume injecté recommandé est de 1 à 2 % du volume mort de la colonne en isocratique, soit 5 à 30 μL pour un diamètre de 4,6 mm, et de 0,5 à 5 μL en UHPLC.

💡 Astuce mémo

Gaz dissous → bulles, instabilité de la pompe et dérive de la ligne de base

📖 18. Détecteurs UV, DAD et spectrométrie de masse

🔑 Notions clés & Définitions

• Spectrométrie de masse : Mesure du rapport m/z des ions formés à partir des solutés élués.

★ À maîtriser

📐 Formule - La loi de Beer-Lambert s’écrit $A = \varepsilon l C$, où A est l’absorbance, ε le coefficient d’absorption molaire, l le chemin optique et C la concentration.

• Le détecteur UV-visible est sensible à la concentration, non destructif et linéaire jusqu’à environ 1 à 1,5 unité d’absorbance ; il ne détecte que les composés absorbants et sa sélectivité est limitée.

• Un détecteur à barrette de diodes disperse le faisceau après la cellule sur 512 ou 1 024 photodiodes, mesurant simultanément l’absorbance à différentes longueurs d’onde et enregistrant des données en fonction du temps, de la longueur d’onde et de l’absorbance.

Compléments

• Dans un détecteur UV-visible, la lumière d’une lampe passe par un monochromateur, traverse une cellule à circulation puis atteint une photodiode ; la lampe au deutérium sert de 190 à 400 nm et la cellule a un chemin optique de 10 mm et un volume de 8 à 14 μL.

📌 La longueur d’onde UV est choisie au maximum d’absorption du soluté tout en évitant la coupure UV du solvant ; à 210 nm, l’acétonitrile, de coupure proche de 190 nm, est préférable au méthanol, de coupure proche de 205–210 nm.

• Le DAD permet d’enregistrer les spectres UV de chaque pic entre 190 et 800 nm, de choisir après l’analyse la longueur d’onde et d’évaluer la pureté du pic en comparant ses spectres au front, au sommet et à la queue ; des composés aux spectres similaires peuvent toutefois coéluer sans être détectés.

📌 L’ESI convient aux composés polaires et ioniques et peut produire des ions multichargés pour les protéines, tandis que l’APCI convient aux composés moins polaires et thermostables de masse inférieure à 1 500 Da.

📌 Les phases mobiles LC-MS utilisent des tampons volatils comme le formiate ou l’acétate d’ammonium, l’acide formique à 0,1 % et l’hydrogénocarbonate d’ammonium ; les phosphates et borates non volatils sont à éviter, de même que la TFA si possible en raison de la suppression d’ionisation en mode positif.

• Les applications du LC-MS comprennent : la bioanalyse et la pharmacocinétique, l’identification d’impuretés et de produits de dégradation, la métabolomique, la protéomique, la toxicologie et le contrôle du dopage, le contrôle des résidus antibiotiques et la caractérisation des protéines thérapeutiques

• Le LC-MS offre une forte sélectivité et une sensibilité de l’ordre du pg, permet l’identification et la quantification simultanées, mais son coût et ses exigences de formation sont élevés et il est exposé aux effets de matrice, à la contamination de la source et aux limites d’ionisation des composés.

💡 Astuce mémo

UV mesure l’absorbance, DAD ajoute le spectre, MS mesure m/z

📖 19. Préparation des phases mobiles et HPLC normale et inverse

★ À maîtriser

• 🔄 La préparation de la phase mobile se déroule dans cet ordre :
  1. Dissoudre 3,40 g de KH₂PO₄ dans 900 mL d’eau.
  2. Ajuster le pH à 3,0 avec H₃PO₄ et compléter à 1 L.
  3. Mélanger séparément 700 mL de tampon et 300 mL de méthanol.
  4. Filtrer à 0,45 μm.
  5. Dégazer 10 min aux ultrasons.
  6. Étiqueter la préparation.

📌 Le pH de la phase aqueuse doit être mesuré et ajusté avant l’ajout du solvant organique, car l’électrode ne mesure pas un pH fiable dans un mélange hydro-organique.

• En NP-HPLC, la phase stationnaire est polaire (silice nue, diol, cyano ou amino) et la phase mobile est apolaire, souvent un alcane avec un modificateur polaire.

• En NP-HPLC, les composés apolaires sont élués avant les composés plus polaires, principalement parce que la rétention repose sur l’adsorption sur les silanols.

• En RP-HPLC, la phase stationnaire est apolaire, par exemple C18, C8 ou phényle, et la phase mobile est polaire, généralement un mélange d’eau et d’acétonitrile ou de méthanol.

• En RP-HPLC, les composés les plus hydrophiles sont élués en premier et les plus hydrophobes en dernier.

📐 Formule - Pour un composé neutre, $\log k = \log k_w - S\cdot\varphi$, où $\varphi$ est la fraction volumique de solvant organique, $k_w$ le facteur de rétention extrapolé à l’eau pure et $S$ une constante propre au soluté, généralement d’environ 3 à 5 pour les petites molécules.

Compléments

• 🔄 La mesure du λmax se réalise ainsi :

  1. Enregistrer le spectre de 200 à 400 nm de chaque solution.
  2. Utiliser comme blanc un mélange méthanol/eau 1:1.
  3. Relever le maximum d’absorption.

• Les valeurs usuelles de λmax sont d’environ 243 nm pour le paracétamol, 273 nm pour la caféine et 222 nm pour l’ibuprofène.

• Pour le calcul du retard d’un gradient au TP, un volume de retard de 1,2 mL à 0,6 mL/min correspond à un retard de 2,0 min.

• La NP-HPLC sert notamment à séparer des isomères de position, des classes de lipides, des vitamines liposolubles, des composés très hydrophobes et des énantiomères sur phases chirales polysaccharidiques.

📌 En NP-HPLC, il faut employer des solvants secs et reproductibles, équilibrer la colonne avec au moins 20 volumes de colonne et éviter le passage direct d’un solvant apolaire à l’eau en utilisant un intermédiaire miscible comme l’isopropanol.

• La NP-HPLC est sensible à l’eau, qui modifie l’activité de la silice et peut rendre les temps de rétention variables ; elle convient mal aux composés ioniques et aux matrices aqueuses.

• En RP-HPLC, l’acétonitrile est souvent le premier choix pour sa faible viscosité, sa faible absorption et son caractère aprotique ; le méthanol, protique et moins cher, offre une sélectivité différente, tandis que le THF peut modifier la sélectivité à faible teneur.

📌 Avec des colonnes C18 classiques, il ne faut pas dépasser 95 % d’eau, car la phase stationnaire risque de s’effondrer ; des phases de type AQ sont prévues pour les conditions 100 % aqueuses.

• La RP-HPLC représente environ 70 à 80 % des analyses HPLC pharmaceutiques et offre une bonne reproductibilité, un équilibrage rapide, une compatibilité avec les matrices aqueuses et un large choix de colonnes.

💡 Astuce mémo

Mesurer le pH, ajouter l’organique, filtrer, puis dégazer

📖 20. Élution isocratique, gradients et choix des phases mobiles

🔑 Notions clés & Définitions

• Élution isocratique : Maintient constante la composition de la phase mobile pendant l’analyse.
• Élution par gradient : Augmente la teneur en solvant organique au cours de l’analyse, ce qui permet d’éluer plus rapidement les composés fortement retenus et d’obtenir des pics de largeur plus comparable.

★ À maîtriser

📌 L’élution isocratique convient aux mélanges simples et aux contrôles de routine, mais lorsque le rapport entre les facteurs de rétention des solutés extrêmes dépasse 20 à 30, les premiers pics peuvent être peu retenus et les derniers élargis.

• Le choix de la phase mobile dépend de la solubilité des analytes et de l’échantillon, de la force éluante, de la viscosité, de la transparence UV, de la compatibilité avec le détecteur, de la toxicité et du coût.

📌 Un tampon est efficace dans l’intervalle pH = pKa ± 1 et sa concentration usuelle est de 10 à 50 mmol/L.

Compléments

📌 Un gradient exploratoire large, par exemple de 5 à 95 % d’acétonitrile en 20 minutes, peut être ajusté pour viser un facteur de rétention moyen à l’élution compris entre 2 et 10.

📌 L’élution par gradient nécessite de tenir compte du volume de retard, d’un rééquilibrage d’au moins 5 à 10 volumes de colonne et d’une dérive possible de la ligne de base ; elle est incompatible avec la détection RI.

📐 Formule - Le facteur de rétention moyen à l’élution d’un gradient est estimé par $k^* \approx \frac{t_G\cdot F}{1{,}15\cdot V_M\cdot\Delta\varphi\cdot S}$.

• 🔄 L’optimisation d’un gradient suit ces étapes :

  1. Commencer par un gradient exploratoire large.
  2. Ajuster la plage et la pente pour obtenir 2 < k* < 10.
  3. Introduire des paliers là où des pics sont groupés.
  4. Vérifier la reproductibilité sur plusieurs cycles.
  5. Maintenir un temps de rééquilibrage suffisant.

• Les mélanges eau-méthanol présentent un maximum de viscosité vers 40 à 60 % de méthanol, ce qui entraîne un maximum de pression.

• Les tampons formiate et acétate sont volatils et compatibles avec la spectrométrie de masse, tandis que le phosphate est non volatil et peut précipiter lorsque la teneur en solvant organique est élevée.

• Le TFA à 0,05–0,1 % favorise l’appariement d’ions et la forme des pics des peptides, mais supprime l’ionisation en mode MS positif.

• 🔄 L’optimisation se fait successivement ainsi :

  1. Ajuster la teneur en solvant organique pour obtenir k ≈ 2–10.
  2. Choisir le type de solvant pour modifier α.
  3. Ajuster le pH et la force ionique pour les composés ionisables.
  4. Ajuster la température.
  5. Contrôler la pression et la ligne de base.

💡 Astuce mémo

Isocratique : composition fixe ; gradient : force éluante croissante.

📖 21. Développement et validation des méthodes HPLC

🔑 Notions clés & Définitions

• Ionisation des solutés : Détermine leur hydrophobie apparente en phase inverse, car la forme ionisée est beaucoup moins retenue que la forme neutre.

★ À maîtriser

• Le choix d’une colonne HPLC dépend des propriétés de l’analyte, de la matrice et de l’objectif analytique ; la sélection peut être optimisée en criblant 3 à 6 colonnes de sélectivités différentes avec le même gradient exploratoire.

• La validation analytique selon ICH Q2(R2), adoptée en 2023, en lien avec ICH Q14, démontre qu’une méthode est adaptée à son usage prévu et garantit la fiabilité des résultats.

• Pour un dosage, la validation examine notamment la spécificité, la linéarité, la justesse, la fidélité, les limites de détection et de quantification, ainsi que la robustesse.

• 🔄 La validation se déroule en cinq étapes :

  1. Rédiger le protocole.
  2. Vérifier l’aptitude du système (SST).
  3. Réaliser les essais et enregistrer les données brutes.
  4. Traiter statistiquement les résultats et rédiger le rapport.
  5. Transférer et surveiller la méthode.

• Avant chaque série, l’aptitude du système est vérifiée à l’aide de Rs, du facteur de traînée, de N et du RSD des aires de 5 à 6 injections, qui doit être ≤ 2 %.

Compléments

• En HPLC, la C18 est une colonne de première intention pour de nombreuses molécules neutres ou ionisables, les phases phényle ou PFP ciblent notamment les aromatiques et les isomères de position, et les phases chirales servent à séparer les énantiomères.

• L’optimisation de la phase mobile commence par un gradient exploratoire de 5 à 95 % d’acétonitrile en 20 à 30 minutes, puis vise une composition isocratique ou un gradient plus étroit donnant k de 2 à 10 ; elle compare ensuite acétonitrile et méthanol, optimise le pH et la température, et peut recourir à un plan d’expériences ou à une simulation.

• À force éluante comparable, le méthanol exige environ 10 à 15 % de plus que l’acétonitrile pour produire la même rétention.

• Pour l’ibuprofène en comprimé, un exemple de méthode utilise une C18 de 150 × 4,6 mm, 5 μm, un mélange acétonitrile/tampon phosphate à pH 2,5–3,0 d’environ 60:40, un débit de 1 mL/min et une détection à 220–230 nm.

📐 Formule - Pour un acide, $\mathrm{pH}=\mathrm{p}K_a+\log\left(\frac{[A^-]}{[HA]}\right)$ ; pour une base, $\mathrm{pH}=\mathrm{p}K_a+\log\left(\frac{[B]}{[BH^+] }\right)$.

📌 Pour maximiser la rétention en phase inverse, un acide est maintenu à pH ≤ pKa − 2 et une base à pH ≥ pKa + 2 ; dans la zone pKa ± 1,5, une variation de pH de ± 0,1 peut modifier fortement le temps de rétention.

• À pH 2 à 3, les silanols sont protonés, ce qui réduit la traînée des bases et constitue un choix par défaut en RP-HPLC.

• L’ibuprofène, de pKa ≈ 4,5, est élué beaucoup plus tôt à pH 7, où il est ionisé, qu’à pH 2,5, où il est non ionisé.

📐 Formule - Le débit contrôle le temps d’analyse selon $t\propto\frac{1}{F}$ et la pression selon $\Delta P\propto F$ ; pour des particules de 5 μm dans une colonne de 4,6 mm, le débit optimal se situe entre 0,8 et 1,2 mL/min.

• Entre 25 °C et 60 °C, la viscosité de l’eau diminue d’environ 0,89 à 0,47 mPa·s ; l’augmentation de température réduit la pression, accroît la diffusion et diminue la rétention de 1 à 3 % par °C en moyenne.

💡 Astuce mémo

Colonne → phase mobile → pH → débit et température → validation.

📖 22. Principes de la CCM et choix des phases chromatographiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie sur couche mince : Séparation de composés déposés sur une fine couche d’adsorbant en fonction de leurs interactions avec cette couche et l’éluant qui migre par capillarité.

★ À maîtriser

• Les applications de la CCM comprennent :

  • le suivi de synthèses
  • le choix d’éluant pour une colonne
  • le criblage phytochimique
  • le contrôle d’identité et d’impuretés
  • l’identification de plantes par empreinte
  • la détection de falsifications
  • la toxicologie de première intention

• Le gel de silice 60 (F254), adsorbant polaire et acide doté d’un indicateur fluorescent à 254 nm, est l’adsorbant le plus courant pour les lipides, alcaloïdes, terpènes, flavonoïdes et médicaments.

📌 L’éluant est optimisé pour obtenir des Rf de 0,2 à 0,8 : on augmente la proportion de solvant polaire si les Rf sont trop faibles et on la réduit s’ils sont trop élevés.

Compléments

• La couche d’adsorbant d’une plaque de CCM mesure 0,1 à 0,25 mm d’épaisseur et repose sur un support inerte en verre, aluminium ou plastique.

• Une cuve non saturée favorise l’évaporation de l’éluant sur la plaque et peut produire des effets de bord, avec des Rf plus élevés sur les bords.

• L’alumine existe sous formes neutre, basique ou acide et convient notamment aux alcaloïdes, composés basiques et hydrocarbures.

• La cellulose, la silice greffée RP-18, la polyamide et le kieselguhr servent respectivement au partage de composés polaires comme les acides aminés et sucres, à la phase inverse pour composés polaires ou ioniques, aux composés formant des liaisons hydrogène comme les phénols et flavonoïdes, et de support inerte pour les phases imprégnées.

• La plaque HPTLC à particules de 5 μm offre une meilleure résolution et une sensibilité supérieure à la plaque TLC à particules de 10 à 12 μm.

• L’ajout de 0,5 à 2 % d’acide acétique ou formique limite la traînée des acides, tandis que 1 à 10 % d’ammoniaque ou de diéthylamine peut limiter celle des bases.

💡 Astuce mémo

Interactions différentes avec l’adsorbant → migrations différentes

📖 23. Développement des plaques, révélation et facteur Rf

★ À maîtriser

• 🔄 La mise en œuvre d’une CCM suit ces étapes :
  1. Tracer les lignes de dépôt et de front.
  2. Déposer échantillons et témoins.
  3. Saturer la cuve et développer la plaque.
  4. Marquer le front et sécher la plaque.
  5. Révéler et mesurer les taches.
  6. Documenter les conditions et le résultat.

📌 Le développement s’effectue avec la plaque verticale, le dépôt hors de l’éluant, une cuve fermée saturée pendant 15 à 30 min et une migration de 5 à 8 cm en TLC ; il s’arrête lorsque le front arrive à 1 cm du bord supérieur.

• Sous UV à 254 nm, les composés absorbants éteignent la fluorescence verte de l’indicateur des plaques F254 et apparaissent comme des taches sombres.

📌 L’observation sous UV, non destructive, doit précéder l’application des réactifs chimiques, et les taches doivent être marquées au crayon.

📐 Formule - Le facteur de rétention est défini par $Rf = dS/dF = 1/(1+k)$, où dS est la distance parcourue par le centre de la tache depuis la ligne de dépôt et dF la distance parcourue par le front du solvant.

• Le Rf dépend notamment de l’adsorbant, de l’éluant, de la saturation, de la température, de l’humidité, de la quantité déposée et des impuretés ; il n’est donc pas une constante absolue et doit être comparé à un témoin migré sur la même plaque.

Compléments

• Les solutions d’échantillon sont généralement préparées à 0,5–1 mg/mL pour des substances pures et à 5–10 mg/mL pour un extrait végétal brut.

• Les dépôts sont réalisés avec 1–5 μL, en taches de 2 à 4 mm, espacées de 1 cm entre elles et des bords ; plusieurs dépôts avec séchage intermédiaire augmentent la quantité sans élargir la tache.

• Les facteurs influençant le développement comprennent :

  • la hauteur d’éluant
  • le couvercle
  • la position dans la cuve
  • la stabilité de la température
  • les courants d’air
  • la propreté de la plaque
  • la fraîcheur de l’éluant

• Sous UV à 365 nm, des composés fluorescents comme les coumarines, flavonoïdes, chlorophylle et quinine émettent leur propre lumière.

• Les réactifs de révélation comprennent : l’iode pour les composés insaturés, lipides et alcaloïdes, la vanilline-acide sulfurique pour les terpènes, stéroïdes, phénols et huiles essentielles, la ninhydrine pour les acides aminés et amines primaires, Dragendorff pour les alcaloïdes, le chlorure ferrique pour les phénols et tanins, NP/PEG ou le chlorure d’aluminium pour les flavonoïdes, Liebermann-Burchard pour les stérols et triterpènes, KOH alcoolique pour les anthraquinones, le bleu de bromocrésol pour les acides organiques, le 2,4-DNPH pour les aldéhydes et cétones

📌 Les réactifs chimiques sont appliqués par pulvérisation en zone ventilée ou par trempage ; la plaque peut ensuite être chauffée à 100–110 °C.

📐 Formule - Le facteur de capacité se calcule par $k = (1-Rf)/Rf$, le facteur hRf par $hRf = 100 \times Rf$ et le Rf relatif par $Rx = Rf(\mathrm{composé})/Rf(\mathrm{référence})$.

• Pour un front de 8,0 cm et des taches situées à 2,4 cm et 5,6 cm, les Rf valent respectivement 0,30 et 0,70, et les k valent 2,33 et 0,43.

• Le Rf sert notamment : à l’identification présomptive par comparaison avec une référence, au contrôle de pureté, au suivi de réaction, au choix d’éluant pour une colonne avec un Rf cible d’environ 0,25, à la semi-quantification visuelle ou par densitométrie en HPTLC

💡 Astuce mémo

À 254 nm, les composés absorbants assombrissent la plaque ; à 365 nm, les composés fluorescents émettent leur lumière

📖 24. Échange d’ions, résines et purification des biomolécules

🔑 Notions clés & Définitions

• Échangeur d’ions : Un échangeur d’ions est une matrice insoluble portant des groupements ionisés fixes, neutralisés par des contre-ions mobiles qui peuvent être remplacés par des ions de l’échantillon de même signe.

★ À maîtriser

• La séparation par échange d’ions comprend l’équilibrage à faible force ionique, le chargement des solutés retenus, le lavage des non-retenus, l’élution par augmentation de la force ionique ou changement de pH, puis la régénération et le nettoyage de la résine.

• Les échangeurs de cations forts portent des sulfonates chargés de pH 1 à 14, tandis que les échangeurs de cations faibles portent des carboxylates chargés au-dessus d’environ pH 4–5.

• Les échangeurs d’anions forts portent des ammoniums quaternaires chargés de pH 1 à 14, tandis que les échangeurs d’anions faibles de type DEAE sont chargés en dessous d’environ pH 9–10.

• Une protéine se fixe sur un échangeur d’anions si le pH est supérieur à son pI et sur un échangeur de cations si le pH est inférieur à son pI ; le pH choisi est éloigné du pI d’au moins 0,5 à 1 unité tout en restant dans la zone de stabilité de la protéine.

Compléments

📌 L’affinité d’un ion pour l’échangeur augmente avec sa charge et diminue lorsque son rayon hydraté augmente.

• L’élution peut utiliser un gradient de NaCl de 0 à 0,5–1 mol/L, linéaire ou par paliers ; la régénération utilise NaCl 1–2 mol/L et le nettoyage en place NaOH 0,5–1 mol/L.

• La chromatographie d’échange d’ions offre une capacité pouvant atteindre 100 mg de protéine par mL de gel, une résolution et une reproductibilité élevées, des conditions aqueuses douces, une concentration de l’échantillon pendant la purification et un coût modéré.

• La capacité totale d’une résine s’exprime en milliéquivalents par gramme ou par millilitre et vaut typiquement 4–5 meq/g pour une résine sèche sulfonée.

• L’albumine sérique, de pI ≈ 4,7, se fixe sur Q-Sepharose à pH 7,5–8 en tampon Tris 20 mmol/L et s’élue par un gradient de NaCl de 0 à 0,5 mol/L ; le lysozyme, de pI ≈ 11, se fixe sur SP- ou CM-Sepharose à pH 7 et s’élue par NaCl.

📌 Pour la purification des protéines, le chargement se fait à faible force ionique, généralement inférieure à 20–50 mmol/L, puis l’élution utilise un gradient linéaire de NaCl étalé sur 10–20 volumes de colonne.

• Le squelette phosphate confère aux acides nucléiques une charge négative forte et uniforme ; ils se fixent sur des échangeurs d’anions comme DEAE ou Q et s’éludent à des concentrations croissantes de NaCl, les molécules plus longues nécessitant une concentration plus élevée.

📌 Une force ionique trop élevée dans l’échantillon empêche sa fixation sur la résine ; l’échantillon doit alors être dessalé ou dilué avant le chargement.

💡 Astuce mémo

pH > pI : échangeur d’anions ; pH < pI : échangeur de cations.

📖 25. Exclusion stérique, masses molaires et choix du gel

🔑 Notions clés & Définitions

• Coefficient de distribution Kd : Le coefficient de distribution Kd décrit la fraction du volume poreux accessible à une molécule en chromatographie d’exclusion stérique et vérifie $Kd = \frac{Ve - V0}{Vt - V0}$, avec $0 \leq Kd \leq 1$.

★ À maîtriser

• Les grosses molécules exclues des pores sont éluées dans le volume interstitiel V0, les petites molécules explorent le volume total Vt = V0 + Vi et les molécules intermédiaires pénètrent partiellement dans les pores.

• Dans la fenêtre de fractionnement du gel, le logarithme de la masse molaire varie approximativement de façon linéaire avec le volume d’élution, selon $\log M = a - b\,Ve$.

📐 Formule - La masse molaire moyenne en nombre est $Mn = \frac{\sum NiMi}{\sum Ni}$, la masse molaire moyenne en masse est $Mw = \frac{\sum NiMi^2}{\sum NiMi}$ et l’indice de polydispersité est $PDI = \frac{Mw}{Mn} \geq 1$.

Compléments

• La séparation par exclusion stérique se produit dans la fenêtre 0 < Kd < 1, entre V0 et Vt, et nécessite un lit suffisamment long.

• Le volume mort V0 se détermine avec le bleu de dextrane 2000, d’environ 2 × 10⁶ Da, tandis que le volume total Vt se détermine avec une petite molécule comme l’acétone, NaCl, la tartrazine ou un dinitrophényl-aminoacide.

• Pour fractionner, le volume injecté représente 1–2 % du volume du lit, tandis qu’un volume pouvant atteindre 30 % convient au dessalage ; la résolution augmente proportionnellement à la racine carrée de la longueur du lit.

• Un mélange contenant 100 chaînes de 10 000 Da et 100 chaînes de 30 000 Da a Mn = 20 000 Da, Mw = 25 000 Da et PDI = 1,25.

• Un polymère monodisperse a un indice de polydispersité PDI égal à 1.

📌 Pour séparer deux protéines, le gel choisi doit avoir un intervalle de fractionnement qui encadre leurs masses ; pour dessaler une protéine de plus de 5 kDa, le Sephadex G-25 exclut la protéine tandis que les petites molécules pénètrent dans ses pores.

📌 Un pore trop grand étale la séparation, tandis qu’un pore trop petit exclut toutes les molécules à séparer.

• La diffusion de lumière multi-angle (MALS) fournit une masse molaire Mw absolue sans étalonnage, tandis que l’étalonnage classique utilise des molécules de masses connues.

💡 Astuce mémo

Les grosses molécules exclues sortent d’abord ; les petites explorent les pores.

📖 26. Dessalage des protéines et manipulation de filtration sur gel

★ À maîtriser

• En dessalage par CES sur Sephadex G-25, la protéine exclue des pores élue près de V0 tandis que les sels pénètrent dans les pores et élue près de Vt.

📌 Pour le dessalage, le volume du lit doit représenter au moins 3,5 à 4 fois le volume de l’échantillon, qui ne dépasse donc pas 25–30 % du volume du lit.

• La colonne est remplie en une fois avec le gel en suspension, laissé à sédimenter jusqu’à 8 mL de lit, puis équilibré avec 3 volumes d’eau.

• Pour déterminer V0 et Vt, déposer 0,5 mL du mélange de bleu de dextrane et de tartrazine, éluer à l’eau, recueillir des fractions de 1 mL et repérer les maxima d’élution des deux marqueurs.

• Dans un lit de 8 mL, le bleu de dextrane est élué en premier vers V0 ≈ 2,5 à 3,5 mL, tandis que la tartrazine élue vers Vt ≈ 6 à 8 mL a un Kd proche de 1.

• 🔄 Le dessalage expérimental suit ces étapes :

  1. Régénérer la colonne avec 3 volumes d’eau.
  2. Déposer 1,5 mL de solution protéine-NaCl.
  3. Éluer à l’eau et recueillir 15 fractions de 1 mL.

• La protéine apparaît dans les premières fractions et les chlorures plus tard ; les fractions 3 à 5 constituent un exemple de fractions contenant la protéine dessalée.

Compléments

• Le dessalage par CES prend quelques minutes, se fait avec peu de dilution et un bon rendement dans des conditions douces, et permet aussi de changer le tampon en équilibrant la colonne dans le tampon final.

• Le tampon de dessalage est celui requis pour l’étape suivante ; une force ionique d’environ 25–50 mmol/L limite les interactions, tandis que 0,1–0,15 mol/L de NaCl peut les supprimer mais risque d’empêcher le dessalage.

• Le protocole de dessalage consiste à faire gonfler le gel, remplir et équilibrer la colonne, déposer l’échantillon, éluer au tampon, analyser les fractions puis réunir celles qui sont riches en protéine et pauvres en sel.

• Pour le TP, 1 g de Sephadex G-25 sec donne environ 4 à 5 mL de lit, et la colonne est ajustée à un volume de lit de 8 mL.

• Dans le suivi du dessalage, l’acide sulfosalicylique révèle la protéine par turbidité et le nitrate d’argent révèle les ions chlorure par la formation d’un précipité blanc de AgCl.

📌 Les résidus de nitrate d’argent doivent être récupérés dans un flacon dédié, l’acide nitrique dilué impose le port de gants et le blanc d’œuf ne doit pas être manipulé en cas d’allergie.

💡 Astuce mémo

Gonfler, remplir, déposer, éluer, analyser.

📊 Tableaux de synthèse

Choix selon la phase mobile

Choix du mécanisme chromatographique