Fiche de révision : Purification et cinétique enzymatiques

📋 Plan du Cours

1. Purification des enzymes
2. Fractionnement cellulaire par centrifugation
3. Bilan de purification enzymatique
4. Nomenclature EC des enzymes
5. Équilibre et vitesse enzymatiques
6. Cinétique de Michaelis-Menten

📖 1. Purification des enzymes

★ À maîtriser

• 🔄 La purification enzymatique suit plusieurs étapes:
  1. Production des enzymes
  2. Élimination des débris
  3. Purification initiale
  4. Purification à haute résolution
  5. Obtention de l’enzyme purifiée

Compléments

• La chromatographie sur polyacrylamide utilise notamment l’acrylamide et le bisacrylamide.

💡 Astuce mémo

Du lysat cellulaire vers l’enzyme purifiée

📖 2. Fractionnement cellulaire par centrifugation

📝 Points essentiels

• La centrifugation différentielle sépare progressivement le lysat cellulaire en culots et surnageants contenant des fractions cellulaires de tailles différentes.

• Une centrifugation à 10 000 g pendant 10 minutes produit un culot contenant les mitochondries et les lysosomes, tandis que le surnageant contient le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi, les ribosomes et les fractions solubles.

💡 Astuce mémo

600 g → 10 000 g → 100 000 g

📖 3. Bilan de purification enzymatique

🔑 Notions clés & Définitions

• Activité spécifique : L’activité spécifique correspond à l’activité enzymatique rapportée à la quantité de protéines, en unités par milligramme.

★ À maîtriser

📐 Formule — L’activité totale se calcule par $A_T = V \times A$, où V est le volume et A l’activité enzymatique par unité de volume.

Compléments

📐 Formule — Le rendement se calcule par $R = \frac{A_{T,\,étape}}{A_{T,\,homogénat}} \times 100$.

📐 Formule — L’enrichissement se calcule par $E = \frac{A_{S,\,étape}}{A_{S,\,homogénat}}$, où AS est l’activité spécifique.

📖 4. Nomenclature EC des enzymes

🔑 Notions clés & Définitions

• Nomenclature EC : La nomenclature EC identifie une enzyme par quatre nombres correspondant au type de réaction catalysée, au substrat général, au substrat ou accepteur spécifique et au numéro de série de l’enzyme.

📝 Points essentiels

• Les numéros EC sont appelés Enzyme Commission Numbers.

💡 Astuce mémo

Réaction → substrat général → spécificité → série

📖 5. Équilibre et vitesse enzymatiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Équilibre chimique : Une réaction réversible est à l’équilibre lorsque les réactions directe et inverse se produisent à la même vitesse.

★ À maîtriser

📐 Formule — Pour la réaction $\alpha A + \beta B \rightleftharpoons \gamma C + \delta D$, la constante d’équilibre s’écrit $K_{eq} = \frac{[C]^\gamma[D]^\delta}{[A]^\alpha[B]^\beta}$.

📐 Formule — La vitesse initiale d’une réaction enzymatique s’écrit $v = \frac{d[P]}{dt} = k_2[ES]$, avec $k_2 = k_p = k_{cat}$.

Compléments

• Les mesures de vitesse sont généralement réalisées en cinétique initiale afin d’éviter l’inhibition par les produits et l’inactivation progressive de l’enzyme.

💡 Astuce mémo

Réaction directe et réaction inverse s’opposent jusqu’à l’équilibre

📖 6. Cinétique de Michaelis-Menten

★ À maîtriser

📐 Formule — L’équation de Michaelis-Menten s’écrit $v = \frac{V_{max}[S]}{K_m + [S]}$.

• Lorsque $[S] \gg K_m$, la réaction est d’ordre zéro et sa vitesse approche $V_{max}$.

📐 Formule — Lorsque $[S] \ll K_m$, la réaction est d’ordre un et sa vitesse vérifie $v = \frac{V_{max}}{K_m}[S]$.

Compléments

📐 Formule — Dans le modèle de Michaelis-Menten, la vitesse maximale vérifie $V_{max} = k_{cat}[E]_0$.

• La linéarisation d’Eadie-Hofstee représente la vitesse V en fonction du rapport V/[S].

💡 Astuce mémo

[S] ≫ Km : ordre 0 ; [S] ≪ Km : ordre 1

📊 Tableaux de synthèse

Régimes limites de Michaelis-Menten