Fiche de révision : Marquage des cellules et des tissus

📋 Plan du Cours

1. Échelles biologiques et résolution
2. Types d’échantillons biologiques
3. Préparation générale des tissus
4. Fixation et conservation structurale
5. Inclusion et durcissement
6. Coupes et préparation des lames
7. Colorations histochimiques
8. Microscopies et immunomarquages
9. Dosage immunologique ELISA

📖 1. Échelles biologiques et résolution

🔑 Notions clés & Définitions

• Résolution microscopique : La plus petite distance nécessaire pour distinguer deux points.

📝 Points essentiels

• La résolution est de 0,2 mm à l’œil nu, de 0,2 μm en microscopie optique et de 0,2 nm en microscopie électronique.

• Les niveaux d’observation sont: organes et tissus à l’œil nu, cellules en microscopie optique, organites et macromolécules en microscopie électronique, protéines, acides nucléiques, lipides et glucides par analyses moléculaires

💡 Astuce mémo

Œil nu → MO → ME → analyses moléculaires

📖 2. Types d’échantillons biologiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Cellules vivantes : Directement issues d’un organisme et maintenues en survie ou en multiplication in vitro par culture.

★ À maîtriser

• Les principaux tests fonctionnels étudient:
  • la prolifération
  • la migration cellulaire
  • le métabolisme

Compléments

• Un frottis sanguin consiste à étaler une goutte de sang sur une lame afin de distinguer les différents types de cellules sanguines.

• Une artère de souris peut être ouverte longitudinalement, aplatie et colorée à l’Oil Red O pour visualiser les plaques d’athérome rouges.

💡 Astuce mémo

Cellules vivantes versus tissus fixés et coupés

📖 3. Préparation générale des tissus

📝 Points essentiels

• La préparation générale d’un tissu comprend le prélèvement, la fixation, l’inclusion et la coupe, puis une méthode de détection, un montage entre lame et lamelle et l’observation au microscope.

📌 La microscopie optique utilise des photons en lumière blanche ou des signaux de fluorescence, tandis que la microscopie électronique utilise des électrons arrêtés par des métaux lourds et des coupes ultrafines.

💡 Astuce mémo

Prélèvement → fixation → inclusion → coupe → détection

📖 4. Fixation et conservation structurale

🔑 Notions clés & Définitions

• Fixation : Immobilise les constituants cellulaires et tissulaires, prévient l’autolyse et la putréfaction, tue les cellules et bloque les activités enzymatiques.

★ À maîtriser

• Les modes de fixation en microscopie optique sont: la fixation à l’air, la fixation au froid, la fixation par des acides, la fixation par des alcools, la fixation par des aldéhydes, la fixation par des mélanges comme le liquide de Bouin

• En microscopie électronique, la préparation comprend une fixation au glutaraldéhyde, éventuellement associé au formaldéhyde, puis une post-fixation au tétroxyde d’osmium.

• Le tétroxyde d’osmium a une forte affinité pour les lipides et forme de l’osmium métallique dense aux électrons, ce qui rend les membranes visibles en noir en microscopie électronique.

Compléments

📌 La fixation doit être réalisée rapidement dans un grand volume de fixateur, pendant une durée dépendant de la taille et de la nature du prélèvement.

💡 Astuce mémo

Fixation rapide → immobilisation des constituants et prévention de l’autolyse

📖 5. Inclusion et durcissement

🔑 Notions clés & Définitions

• OCT : Matrice liquide à 20°C et solide à une température inférieure ou égale à -20°C.

★ À maîtriser

• 🔄 L’inclusion en paraffine suit les étapes: déshydratation par des bains d’éthanol de degrés croissants, passage dans le xylène ou le toluène, inclusion dans la paraffine liquide à 56°, durcissement et obtention d’un bloc

• La paraffine dissout les lipides, qui ne peuvent donc pas être observés dans une préparation incluse en paraffine.

• L’inclusion en OCT préserve les lipides, les sites antigéniques et les activités enzymatiques, surtout en l’absence de fixation, et les blocs sont conservés à -80°C.

Compléments

• L’inclusion en résine d’époxy, comme l’Epon ou l’araldite, nécessite une déshydratation et une imprégnation solvant-résine avant polymérisation afin d’obtenir la solidité nécessaire aux coupes ultrafines.

💡 Astuce mémo

Paraffine : morphologie ; OCT : lipides, antigènes et enzymes

📖 6. Coupes et préparation des lames

★ À maîtriser

• Les coupes de paraffine et d’OCT mesurent de 2 μm à 10 μm d’épaisseur.

• En microscopie électronique en transmission, une coupe semi-fine de 1 à 2 μm sert à repérer la zone d’intérêt avant une coupe ultrafine de 50 à 80 nm réalisée à l’ultramicrotome avec une lame de diamant.

• Avant le marquage d’une section de paraffine, il faut déparaffiner au toluène, réhydrater par des alcools décroissants, marquer, déshydrater par des alcools croissants avec un solvant, puis monter en résine hydrophobe.

📌 La paraffine conserve mieux les structures et permet les colorations classiques, tandis que l’OCT préserve les lipides, les sites antigéniques et les activités enzymatiques mais conserve moins bien les structures.

Compléments

• Le cryostat réalise des coupes d’OCT dans une enceinte réfrigérée entre -18°C et -22°C, puis la coupe adhère à une lame de verre lorsqu’elle fond.

💡 Astuce mémo

Déparaffiner ou décongeler → marquer → monter

📖 7. Colorations histochimiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Réticuline : Constituée de fibres de collagène de type III présentes notamment dans les ganglions lymphatiques, le foie et les adipocytes.

★ À maîtriser

• En microscopie électronique en transmission, l’acétate d’uranyle augmente le contraste du noyau et des ribosomes, tandis que le citrate de plomb augmente celui des membranes.

• La métallisation en microscopie électronique à balayage ajoute une couche d’or-palladium de 10 nm, permettant la réflexion des électrons et l’analyse des surfaces en 3D avec une résolution de 10 nm.

📌 Une structure acidophile a une affinité pour les colorants acides, tandis qu’une structure basophile a une affinité pour les colorants basiques.

• L’hématoxyline colore les noyaux en bleu ou violet et l’éosine colore le cytoplasme en rose dans la coloration hématoxyline-éosine.

• Le trichrome HES met le collagène en jaune ou ocre grâce au safran, tandis que le rouge Sirius colore le collagène en rouge foncé et permet sa polarisation.

• La réaction PAS met en évidence les glucides en oxydant leurs fonctions alcool en fonctions aldéhydes, qui transforment le réactif de Schiff en une coloration rose, rouge ou fuchsia.

• Les composés réagissant avec le PAS sont:

  • le glycogène
  • les mucines neutres
  • l’acide hyaluronique et les membranes basales
  • les glycoprotéines
  • les glycolipides
  • les lipopigments

• La spécificité de la réaction PAS pour le glycogène est vérifiée par un traitement à la diastase, qui dégrade le glycogène et fait disparaître la coloration.

• La méthode de Perls colore en bleu-vert les composés contenant du fer ferrique en présence de ferrocyanure de potassium et d’acide chlorhydrique.

Compléments

• La coloration de May-Grünwald-Giemsa associe le bleu de méthylène et l’éosine dans May-Grünwald, ainsi que l’azur de méthylène et l’éosine dans Giemsa, pour les frottis sanguins et les échantillons hématologiques ou lymphoïdes.

• L’orcéine colore les fibres élastiques en rouge ou rose, tandis que la fuchsine-résorcine les colore en bleu ou violet.

💡 Astuce mémo

Colorations topographiques versus réactions ciblant un constituant

📖 8. Microscopies et immunomarquages

★ À maîtriser

• Le DAPI et le Hoechst se lient à l’ADN et émettent une fluorescence bleue, tandis que la phalloïdine-rhodamine se lie spécifiquement à l’actine F et émet une fluorescence rouge.

📌 La co-localisation est suggérée par la superposition de plusieurs couleurs fluorescentes, alors que l’absence de superposition indique que les protéines d’intérêt ne sont pas co-localisées.

• 🔄 Un immunomarquage suit les étapes:
  1. fixation
  2. perméabilisation
  3. saturation des sites non spécifiques
  4. incubation avec des anticorps spécifiques

📌 La méthode directe utilise un seul anticorps primaire marqué et fournit un signal moins important, tandis que la méthode indirecte utilise un anticorps primaire et un anticorps secondaire marqué, ce qui augmente le signal mais peut accroître le bruit de fond.

Compléments

• En MET, l’immunolocalisation couple les anticorps à une bille d’or et permet d’observer les membranes, lipides, grains de glycogène, vésicules et organites.

• Les principaux couplages d’anticorps sont:

  • une enzyme
  • un agent chimioluminescent
  • un fluorochrome
  • un élément radioactif
  • une particule d’or colloïdal

💡 Astuce mémo

Direct : signal simple ; indirect : signal amplifié mais bruit accru

📖 9. Dosage immunologique ELISA

🔑 Notions clés & Définitions

• ELISA : Dosage immunologique réalisé en solution liquide pour détecter ou quantifier un antigène ou un anticorps à l’aide d’anticorps spécifiques et d’une enzyme conjuguée.

📝 Points essentiels

• L’ELISA produit un signal coloré, fluorescent ou chimioluminescent dont la lecture se fait par densité optique ou unités de fluorescence.

📌 L’ELISA direct utilise un anticorps primaire conjugué, l’ELISA indirect utilise un anticorps secondaire conjugué et l’ELISA sandwich capture l’antigène entre un anticorps de capture et des anticorps de détection.

📌 L’ELISA sandwich permet un dosage quantitatif lorsque l’intensité du signal est comparée à une gamme étalon de concentrations connues.

💡 Astuce mémo

Capture → anticorps de détection → signal mesurable

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison paraffine et OCT

Méthodes ELISA