Comment la PCR classique et la PCR en temps réel sont-elles analysées ?
La PCR classique est analysée en point final par électrophorèse sur gel d’agarose, tandis que la PCR en temps réel suit la fluorescence cycle après cycle.
De quelle molécule la matrice d’une PCR doit-elle être constituée ?
D’ADN.
En quoi l’ARN est-il rétrotranscrit avant une RT-PCR ou une RT-qPCR ?
En ADNc.
Quel équipement optique nécessite la PCR en temps réel ?
Un thermocycleur muni d’un module optique.
Qu’est-ce qu’une amorce utilisée en PCR ou en hybridation ?
Un court fragment d’acide nucléique, d’ARN ou d’ADN, généralement obtenu par synthèse chimique.
Combien d’amorces et quels types utilise une PCR pour encadrer l’ADN à amplifier ?
Deux amorces : une Forward et une Reverse.
Quelle longueur d’amorces le cours recommande-t-il pour la RT-qPCR ?
20 à 25 nucléotides.
Quelle teneur en GC le cours recommande-t-il pour les amorces de RT-qPCR ?
40 à 60 %.
Quel Tm le cours recommande-t-il pour les amorces de RT-qPCR ?
Un Tm proche de 65 °C.
À quel équilibre moléculaire correspond la température de fusion (Tm) de l’ADN ?
À l’équilibre, 50 % des molécules sont simple brin et 50 % double brin.
Comment règle-t-on la température d’hybridation des amorces par rapport à leurs Tm moyens ?
Environ 5 °C sous la moyenne des Tm des deux amorces.
Quelles sont les trois étapes répétées de la PCR classique ?
Dénaturation, hybridation des amorces, puis élongation.
À quelle température la dénaturation de la PCR classique a-t-elle lieu ?
À 95 °C.
Avec SYBR Green ou EvaGreen, à quoi est proportionnelle la fluorescence émise ?
À la quantité d’ADN double brin produite.
Après les cycles de PCR, comment la température évolue-t-elle pendant la mesure des courbes de fusion ?
Elle augmente progressivement.
Quel paramètre les courbes de fusion permettent-elles de déterminer pour les amplicons ?
Leur Tm.
À quoi servent les courbes de fusion en PCR ?
À vérifier la spécificité de la PCR.
Que désigne le Ct, ou Cq, en PCR en temps réel ?
Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre le seuil de fluorescence.
Sur une courbe d’amplification, où se lit le Ct ?
À l’abscisse du point d’intersection avec le seuil de fluorescence.
À seuil identique, qu’indique un Ct élevé sur la quantité initiale de matrice ?
Une quantité initiale de matrice plus faible.
À partir de quelles données les courbes d’amplification estiment-elles la quantité initiale de matrice N₀ ?
Du Ct et de la fluorescence mesurée au cours des cycles.
Quelle est la loi générale d’amplification de la PCR ?
Quelle loi décrit l’amplification PCR lorsque l’efficacité vaut 100 % ?
Comment estime-t-on en quantification absolue après avoir déterminé le Ct ?
À partir de l’équation d’amplification et de l’efficacité .
Quelle formule calcule l’efficacité à partir de la pente d’une droite standard ?
Quel rapport relie les quantités initiales de deux échantillons d’efficacité E ?
Quel rapport obtient-on lorsque l’efficacité E vaut 1 ?
Qu’est-ce qu’un gène de référence en quantification relative ?
Un gène à expression constitutive dont l’ADNc sert de cible REF pour normaliser la quantité de GOI.
Quelle formule donne la quantité normalisée si les efficacités du GOI et du REF valent 1 ?
, avec .
Quelle méthode et quelle référence bibliographique sont associées au calcul par ?
La méthode comparative de Livak, KJ Livak, Methods, 2001.
Que permet de quantifier la RT-qPCR ?
La quantité initiale de transcrits ciblés dans un échantillon.
Que permet de rechercher la PCR en temps réel dans l’ADN ?
Des mutations ou des SNP.
Quelles informations la PCR classique fournit-elle sur les produits amplifiés ?
Elle renseigne sur leur présence ou leur absence, leur taille et le nombre d’amplicons.
Qu’évalue notamment l’analyse des produits en PCR classique ?
La spécificité de la PCR.
Pour combien de cycles la PCR classique est-elle présentée comme semi-quantitative ?
Pour moins de 15 à 20 cycles.
Quelle est l’application quantitative principale de la PCR en temps réel ?
La qPCR.
Quels types d’ARN trouve-t-on dans une préparation d’ARN total ?
Des ARNm, des ARNr et des ARNt, entre autres.
Quelle étape distingue la RT-PCR de la PCR lorsque l’échantillon initial contient de l’ARN ?
Une rétrotranscription préalable.
Quels agents fluorescents se lient à l’ADN double brin en PCR en temps réel ?
Des agents comme SYBR Green.
Quelle molécule fluorescente est aussi appelée sonde d’hydrolyse ?
La sonde TaqMan.
Quelle taille d’amplicon le cours recommande-t-il pour la RT-qPCR ?
Entre 50 et 200 pb.
Comment placer les amorces pour limiter l’amplification d’ADNg contaminant dans un échantillon d’ARN ?
Dans des exons séparés par un intron, afin que l’amplicon d’ADNg soit plus long que celui d’ADNc ou dépasse 1000 pb.
Que provoque la dénaturation de l’ADN au niveau de la double hélice ?
La séparation des deux brins par rupture des liaisons hydrogène.
Quelle formule le cours donne-t-il pour le Tm des fragments d’ADN de moins de 18 à 20 résidus ?
De quoi dépend le Tm de l’ADN ?
De sa composition en bases.
Comment détermine-t-on le Tm des fragments d’ADN de plus de 35 résidus ?
Par mesure expérimentale ou par calcul thermodynamique.
À quelle température la Taq polymérase a-t-elle une activité optimale ?
À 72 °C.
Quel est le rôle du Hot Start dans le programme de PCR en temps réel ?
Il active l’ADN polymérase.
Combien de cycles d’amplification comporte le programme de PCR en temps réel présenté ?
40 cycles.
Quel appareil réalise la PCR classique ?
Un thermocycleur.
Quel équipement optique distingue le thermocycleur de PCR en temps réel ?
Un module optique qui enregistre la fluorescence.
Que peuvent produire des amplicons non spécifiques sur une courbe de fusion ?
Des pics ou des épaulements supplémentaires.
Quand la PCR classique est-elle analysée ?
À la fin de la réaction.
Dans l’exemple du cours, de quel cycle à quel cycle la PCR en temps réel visualise-t-elle l’amplification ?
Du cycle 1 au cycle 40.
Comment construit-on une droite standard absolue ?
On relie les Ct expérimentaux au logarithme de pour des dilutions en cascade de quantité initiale connue.
Quel intervalle d’efficacité le cours considère-t-il acceptable ?
Avec Ct₁ = 10, Ct₂ = 15 et une efficacité de 100 %, combien de GOI l’échantillon 1 contient-il par rapport à l’échantillon 2 ?
32 fois plus de GOI.
Quelle différence la comparaison relative sans normalisation ignore-t-elle ?
Les différences de quantité totale de matériel analysé.
Quel rapport exprime la normalisation lorsque les efficacités du GOI et du REF sont égales ?
Quelle taille d’amplicon obtient-on dans l’exercice avec les amorces proposées ?
261 pb, calculés comme (482−222)+1.
Quel Tm un produit PCR pur peut-il présenter dans l’exemple du cours ?
80 °C.
Dans quels puits les dimères d’amorces peuvent-ils être particulièrement visibles ?
Dans les puits NTC sans matrice.
Quel Tm le cours associe-t-il aux pics ou épaulements dus aux dimères d’amorces ?
Environ 70 à 76 °C.
Quel facteur de dilution en cascade est utilisé pour la matrice connue de l’exemple absolu ?
Dans l’exemple de droite standard relative, quel est le facteur de dilution en cascade ?
1/5.
Teste tes connaissances avec un QCM de 28 questions sur Initiation à la RT-qPCR.
1. Comment diffèrent le suivi de la PCR classique et celui de la PCR en temps réel ?
2. Quelle méthode est principalement utilisée pour quantifier une amplification, et dans quelles conditions la PCR classique est-elle décrite comme semi-quantitative ?
Révisez le cours complet dans la fiche de révision de Initiation à la RT-qPCR.
Voir la fiche →Importe ton cours et l'IA génère des flashcards en 30 secondes.
Générateur de flashcards