Fiche de révision : Introduction aux biotechnologies et Western blot

📋 Plan du Cours

1. Objectifs et évaluation de l’UE
2. Interventions et professionnalisation
3. Principes biologiques du Western blot
4. Préparation des échantillons protéiques
5. Électrophorèse SDS-PAGE
6. Transfert et détection des protéines

📖 1. Objectifs et évaluation de l’UE

📝 Points essentiels

• L’UE vise à acquérir les notions des techniques de base réalisées en laboratoire et en travaux pratiques, à expliquer et analyser leurs résultats, à présenter oralement une technique et à interagir avec des intervenants extérieurs pour enrichir son portfolio.

• Les modalités d’évaluation comprennent: un contrôle continu avec une possibilité d’évaluation à chaque séance, une évaluation intermédiaire courant novembre, une évaluation finale courant décembre, des notes d’oraux en novembre, des notes attribuées par les intervenants extérieurs

💡 Astuce mémo

Savoir, analyser, présenter, échanger

📖 2. Interventions et professionnalisation

★ À maîtriser

📌 Les interventions extérieures permettent de faire le lien entre la formation et le monde professionnel et de prendre des contacts dans l’objectif de trouver des stages.

Compléments

📌 Durant les séances avec les intervenants extérieurs, l’étudiant doit avoir une tenue correcte et être proactif.

💡 Astuce mémo

Intervenants extérieurs → liens professionnels et contacts pour les stages

📖 3. Principes biologiques du Western blot

🔑 Notions clés & Définitions

• Western blot : Octavia ANTONOFF — Technique permettant d’étudier le niveau d’expression des protéines de manière semi-quantitative dans des échantillons variés et des populations cellulaires, à partir d’un grand nombre de cellules provenant notamment de cultures ou de tissus.

★ À maîtriser

• 🔄 Les principales étapes du Western blot sont:
  1. préparation des échantillons
  2. électrophorèse en conditions dénaturantes
  3. transfert des échantillons
  4. blocage et incubation avec les anticorps
  5. détection et analyse

Compléments

• Les protéines étudiées par Western blot sont décrites selon une structure primaire, une structure secondaire et une structure tertiaire.

💡 Astuce mémo

Primaire → secondaire → tertiaire

📖 4. Préparation des échantillons protéiques

★ À maîtriser

• 🔄 La préparation d’un lysat cellulaire comprend: la lyse cellulaire, une centrifugation à 12000g pendant 15 minutes, la récupération du surnageant contenant les protéines totales

• Pour préparer les protéines à l’électrophorèse SDS-PAGE, on ajoute le tampon de charge à l’échantillon, on chauffe à 95 °C pendant 5 minutes, on centrifuge à 16000g pendant 5 minutes, puis on conserve l’échantillon à -20 °C ou on l’utilise.

Compléments

• Le tampon de charge contient:
  • du Laemmli
  • du glycérol
  • du SDS
  • du β-mercaptoéthanol
  • du tampon Tris
  • du bleu de bromophénol

💡 Astuce mémo

Lyser → centrifuger → chauffer → conserver

📖 5. Électrophorèse SDS-PAGE

🔑 Notions clés & Définitions

• Gel de concentration : Gel de polyacrylamide à 5 % qui synchronise les protéines avant leur entrée dans le gel de séparation.

★ À maîtriser

• Le gel de séparation, ou running gel, contient un pourcentage variable de polyacrylamide et permet la séparation des protéines après leur passage dans le gel de concentration.

Compléments

• La migration SDS-PAGE s’effectue dans un champ électrique, et une coloration au bleu de Coomassie permet de visualiser les protéines dans le gel.

💡 Astuce mémo

Gel de concentration : synchroniser ; gel de séparation : séparer

📖 6. Transfert et détection des protéines

📝 Points essentiels

• 🔄 Le transfert des protéines sur membrane comprend: retirer le gel de concentration, plonger le gel de séparation dans le tampon de transfert, plonger les papiers filtres et les éponges dans le tampon de transfert, plonger la membrane PVDF dans le méthanol, assembler le sandwich de transfert

• 🔄 La révélation après transfert comprend:

  1. le blocage
  2. l’incubation avec les anticorps
  3. les lavages
  4. la réaction enzymatique
  5. l’obtention d’un résultat observable

💡 Astuce mémo

Transférer → bloquer → incuber → laver → révéler

📊 Tableaux de synthèse

Fonction des gels SDS-PAGE