Fiche de révision : Modification des génomes bactériens

📋 Plan du Cours

1. Piliers de l’ingénierie génétique bactérienne
2. Vecteurs plasmidiques et transferts d’ADN
3. PCR et clonage par restriction-ligation
4. Assemblages Golden Gate et homologie
5. Mutagénèse globale par transposons
6. Tn-seq et RB-Tn-seq
7. Recombinaison homologue ciblée
8. CRISPR-Cas9 et édition ciblée
9. CRISPRi et régulation génétique
10. Applications biotechnologiques

📖 1. Piliers de l’ingénierie génétique bactérienne

📝 Points essentiels

• Les trois piliers sont:
  • le clonage moléculaire et la PCR
  • l’introduction d’ADN exogène
  • la réparation endogène par recombinaison homologue

📌 La plupart des bactéries ne possèdent pas de système fonctionnel de jonction non homologue des extrémités, ou NHEJ, alors qu’elles peuvent réparer l’ADN par recombinaison homologue.

💡 Astuce mémo

Cloner, faire entrer, réparer

📖 2. Vecteurs plasmidiques et transferts d’ADN

🔑 Notions clés & Définitions

• Plasmide : Vecteur d’ADN bactérien comportant une origine de réplication, au moins un gène de sélection et un site de clonage multiple

★ À maîtriser

📌 La transformation introduit directement de l’ADN nu par traitement chimique ou électroporation, la transduction le transfère par un phage et la conjugaison le transfère par contact direct via un pilus sexuel.

Compléments

• Le plasmide pUC19 peut atteindre environ 500 à 700 copies par cellule d’E. coli.

💡 Astuce mémo

Transformation = ADN nu ; conjugaison = contact

📖 3. PCR et clonage par restriction-ligation

📝 Points essentiels

• La PCR amplifie une région ciblée par des cycles successifs de dénaturation, d’hybridation des amorces et d’élongation à 72 °C, répétés environ 30 fois.

• Le clonage par restriction-ligation linéarise le plasmide et l’insert avec la même enzyme de restriction, relie leurs extrémités par une ligase, transforme une souche de clonage puis sélectionne les transformants.

💡 Astuce mémo

Dénaturer, hybrider, élonger

📖 4. Assemblages Golden Gate et homologie

★ À maîtriser

• Golden Gate utilise des enzymes de restriction de type IIS, comme BsaI ou BbsI, qui coupent en dehors de leur site de reconnaissance afin d’assembler plusieurs fragments dans un ordre précis au cours d’une réaction alternant restriction et ligature.

📌 Gibson Assembly assemble plusieurs fragments possédant des extrémités homologues d’environ 20 à 40 paires de bases grâce à une exonucléase, une ADN polymérase et une ligase en une seule réaction in vitro.

• Le clonage IVA amplifie par PCR un plasmide entier avec des amorces portant la modification, élimine l’ADN matrice méthylé par DpnI, puis laisse E. coli circulariser le plasmide linéaire par ses systèmes de réparation.

Compléments

• SLIC et TEDA sont des variantes de Gibson dans lesquelles l’hybridation des fragments est suivie d’une réparation par la machinerie bactérienne après transformation, sans ligase ajoutée in vitro.

💡 Astuce mémo

Golden Gate utilise des sites IIS ; Gibson utilise l’homologie

📖 5. Mutagénèse globale par transposons

🔑 Notions clés & Définitions

• Transposon : Élément génétique mobile capable de changer de position dans un génome et portant un ou plusieurs gènes, avec une transposase et des séquences terminales répétées IR

📝 Points essentiels

📌 La transposition conservative excise le transposon puis l’insère ailleurs, tandis que la transposition réplicative conserve le transposon initial et en insère une copie à un autre endroit.

• Une banque de mutants est créée par insertion aléatoire de transposons, puis les mutants sont soumis à un criblage phénotypique afin de relier un gène à une fonction.

💡 Astuce mémo

Cut and paste déplace ; copy and paste duplique

📖 6. Tn-seq et RB-Tn-seq

★ À maîtriser

• Tn-seq crée une banque de mutants par transposition, cultive cette banque dans une condition donnée, séquence les jonctions transposon-génome et cartographie les insertions pour identifier les loci nécessaires à la croissance.

📌 RB-Tn-seq associe à chaque mutant un code-barres ADN unique, permettant de comparer l’abondance des mutants avant et après une condition de croissance sélective.

Compléments

📌 Les méthodes Tn-seq sont limitées par les biais d’insertion, comme la préférence du transposon mariner pour les sites TA ou les points chauds d’insertion de Tn5, et elles ne permettent pas d’étudier directement les gènes essentiels dans une condition donnée.

💡 Astuce mémo

Insérer, sélectionner, séquencer, cartographier

📖 7. Recombinaison homologue ciblée

📝 Points essentiels

• Lors d’une recombinaison homologue bactérienne, une exonucléase produit une extrémité simple brin 3′-OH, RecA permet son invasion dans une région homologue, l’ADN polymérase copie la séquence puis une ligase scelle la réparation.

📌 Le gène sacB permet une contre-sélection chez de nombreuses bactéries Gram négatif, car sa levansucrase produit du levan toxique en présence de saccharose, mais ce système est inutilisable chez les bactéries Gram positif.

• Le système λ-Red comprend les protéines Exo, Bet et Gam : Exo produit un intermédiaire simple brin, Bet favorise la recombinaison homologue et Gam inhibe RecBCD.

💡 Astuce mémo

RecA recombine l’ADN homologue → modification ciblée

📖 8. CRISPR-Cas9 et édition ciblée

🔑 Notions clés & Définitions

• Base editor : Fusion entre une Cas9 nickase et une désaminase qui convertit C en T ou A en G sans créer de cassure double brin

★ À maîtriser

• Dans le système CRISPR-Cas9 de Streptococcus pyogenes, un sgRNA guide Cas9 vers une séquence cible de 20 nucléotides adjacente à un PAM NGG, puis Cas9 clive les deux brins de l’ADN.

📌 Le couplage CRISPR-Cas9 et λ-Red permet une modification sans marqueur, car λ-Red intègre l’ADN donneur et Cas9 élimine les cellules non recombinées par contre-sélection.

Compléments

• Avec SpCas9 et une cytidine désaminase, la fenêtre d’édition typique se situe aux positions 4 à 8 en amont du PAM.

💡 Astuce mémo

Cas9 coupe deux brins ; base editor modifie une base

📖 9. CRISPRi et régulation génétique

🔑 Notions clés & Définitions

• CRISPRi : Utilise une dCas9 dépourvue d’activité nucléase mais capable de se fixer à l’ADN et de bloquer physiquement la transcription guidée par un sgRNA

📝 Points essentiels

📌 La fixation de dCas9 au promoteur empêche le recrutement de l’ARN polymérase, tandis que sa fixation dans la région codante bloque l’élongation de la transcription.

📌 CRISPRi est réversible, ne modifie pas le génome et peut réprimer simultanément plusieurs gènes avec plusieurs sgRNA.

💡 Astuce mémo

CRISPRi réprime ; CRISPRa active

📖 10. Applications biotechnologiques

★ À maîtriser

• Une souche biosécurisée de Pseudomonas putida KT2440 modifiée a complètement éliminé six pesticides à raison de 50 mg/kg de sol chacun en 15 jours.

• La bioproduction d’insuline humaine par E. coli repose sur le clonage du gène humain, l’expression de la protéine recombinante puis sa purification, avec élimination des introns et prise en compte des codons rares.

• Les contraintes principales sont:

  • l’efficacité de transformation
  • la réplication des plasmides
  • la fréquence de recombinaison
  • la méthylation de l’ADN
  • les systèmes de réparation de l’ADN
  • la toxicité de Cas9
  • les effets hors cible

Compléments

• L’ingénierie de phages peut modifier leur spectre d’hôte, produire des phages diagnostiques ou thérapeutiques et réduire la charge bactérienne dans des biofilms ou chez l’animal.

💡 Astuce mémo

Diagnostiquer, traiter, dépolluer, produire

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des méthodes de clonage

Outils de mutagénèse ciblée