Fiche de révision : Structure et analyse des protéines

📋 Plan du Cours

1. Fondements de la biochimie
2. Cellules et fractionnement cellulaire
3. Classification des acides aminés
4. Propriétés physiques et ioniques
5. Réactivité des acides aminés
6. Dosage et séparation analytique
7. Chromatographies des acides aminés
8. Chromatographie et séquençage protéique
9. Organisation structurale des protéines
10. Propriétés et dénaturation protéiques
11. Isolement et purification des protéines
12. Électrophorèse SDS-PAGE
13. Migration en SDS-PAGE
14. Coloration et analyse du gel
15. Dosage spectrophotométrique des protéines
16. Hydrolyse et composition des protéines
17. Méthodes de séquençage protéique

📖 1. Fondements de la biochimie

🔑 Notions clés & Définitions

• Biochimie : Étude de la chimie du vivant.

📝 Points essentiels

• Les cellules vivantes contiennent notamment:
  • 80-90 % d’eau
  • des protéines
  • des enzymes
  • des glucides
  • des lipides
  • des acides nucléiques
  • des hormones
  • des vitamines
  • des minéraux et des électrolytes

📌 L’anabolisme forme des molécules complexes à partir de composés simples et demande de l’énergie, tandis que le catabolisme dégrade des composés complexes en molécules simples et libère de l’énergie.

💡 Astuce mémo

Biochimie statique = structures ; biochimie dynamique = métabolisme

📖 2. Cellules et fractionnement cellulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Mitochondrie : Organite cytoplasmique qui participe à la production d’énergie et au catabolisme des acides gras.

★ À maîtriser

• Le noyau contient l’ADN et l’ARN, tandis que les ribosomes assemblent les protéines dans le cytoplasme.

• Le réticulum endoplasmique lisse synthétise les lipides complexes, tandis que le réticulum endoplasmique rugueux synthétise les protéines.

Compléments

• Le fractionnement cellulaire commence par l’homogénéisation des tissus, puis la lyse cellulaire peut être réalisée chimiquement, physiquement ou par une combinaison des deux méthodes.

💡 Astuce mémo

Homogénéiser → lyser → centrifuger

📖 3. Classification des acides aminés

★ À maîtriser

• Environ 40 acides aminés sont d’origine protéique, mais 20 acides aminés standards se retrouvent dans toutes les protéines.

• Les acides aminés standards sont classés en: groupements non polaires hydrophobes, groupements polaires non ionisables, groupements polaires ionisables, positivement ou négativement chargés

Compléments

• Le pH physiologique moyen est de 7,4 et correspond approximativement au pH du sang.

💡 Astuce mémo

NPI : non polaires, polaires non ionisables, polaires ionisables

📖 4. Propriétés physiques et ioniques

🔑 Notions clés & Définitions

• Activité optique : Capacité d’une molécule chirale en solution à dévier un rayon de lumière polarisée vers la droite ou vers la gauche.

📝 Points essentiels

📌 Les acides aminés sont chiraux sauf la glycine, et la forme L est la forme naturellement retrouvée chez les acides aminés.

• La tyrosine, la phénylalanine et le tryptophane absorbent la lumière UV en raison de leur aromaticité, et la tyrosine est utile pour le dosage des protéines à 280 nm.

📐 Formule — Pour un acide aminé à chaîne latérale non ionisable, le point isoélectrique vérifie $pI=\frac{1}{2}(pK_1+pK_2)$.

📌 À pH égal au pI, l’acide aminé est électriquement neutre et ne migre pas dans un champ électrique; à pH supérieur au pI, il est globalement négatif et migre vers l’anode; à pH inférieur au pI, il est globalement positif et migre vers la cathode.

💡 Astuce mémo

pH > pI : anion vers l’anode ; pH < pI : cation vers la cathode

📖 5. Réactivité des acides aminés

★ À maîtriser

• L’oxydation des groupements sulfhydryle de la cystéine entraîne la formation de ponts disulfure qui stabilisent la structure tridimensionnelle des protéines.

Compléments

• La réaction à la ninhydrine est une déamination oxydative utilisée pour révéler les acides aminés, notamment en chromatographie sur couche mince.

💡 Astuce mémo

Oxydation des groupes SH → ponts disulfure

📖 6. Dosage et séparation analytique

🔑 Notions clés & Définitions

• Électrophorèse : Séparation d’ions par déplacement différentiel sur un support sous l’effet d’un champ électrique.

📝 Points essentiels

• Les acides aminés aromatiques absorbent les rayons UV à 280 nm, la réaction à la ninhydrine produit une coloration violette mesurée à 570 nm, et la proline ou l’hydroxyproline produisent une coloration jaune mesurée à 440 nm.

💡 Astuce mémo

Doser → séparer → révéler

📖 7. Chromatographies des acides aminés

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie échangeuse d’ions : La chromatographie échangeuse d’ions sépare des molécules chargées grâce à une phase stationnaire solide chargée, puis les élue par un gradient de sel ou une variation de pH.

📝 Points essentiels

📌 Si le pH du tampon est inférieur au pI de l’acide aminé, celui-ci est positif et une résine échangeuse de cations est utilisée; si le pH est supérieur au pI, il est négatif et une résine échangeuse d’anions est utilisée.

• 🔄 Une chromatographie sur papier suit ces étapes:

  1. Déposer l’échantillon sur le papier
  2. Placer le papier dans le solvant
  3. Laisser le solvant migrer par capillarité
  4. Marquer le front du solvant et sécher le papier
  5. Révéler les acides aminés

• La chromatographie de partage repose sur la différence de solubilité entre deux liquides non miscibles, tandis que la chromatographie d’adsorption retient les molécules sur un solide tel que la silice selon leur polarité.

💡 Astuce mémo

Échange d’ions = charge ; partage = solubilité ; adsorption = polarité

📖 8. Chromatographie et séquençage protéique

📝 Points essentiels

📌 La chromatographie d’adsorption est une chromatographie solide-liquide utilisant un adsorbant, généralement une couche de silice fixée sur une plaque, tandis que la chromatographie sur papier est une chromatographie liquide-liquide.

• En chromatographie sur couche mince, les molécules sont entraînées par un éluant mobile et plus ou moins retenues par adsorption sur la silice selon leur polarité, en raison d’interactions polaires avec la phase stationnaire.

• La HPLC est une méthode rapide et très sensible utilisée pour analyser des mélanges complexes d’acides aminés, mais sa colonne possède une faible capacité.

• La méthode d’Edman permet de déterminer la séquence d’une protéine à partir de son extrémité N-terminale, puis le fragment libéré est identifié par HPLC.

💡 Astuce mémo

Adsorption sur silice, HPLC pour séparer rapidement, Edman pour identifier l’extrémité N-terminale

📖 9. Organisation structurale des protéines

🔑 Notions clés & Définitions

• Liaison peptidique : Relie deux acides aminés entre la fonction α-aminée de l’un et la fonction α-carboxylée de l’autre.
• Protéine : Molécule composée de plus de 100 acides aminés ou de plusieurs chaînes polypeptidiques, et dont la masse moléculaire est exprimée en daltons.
• Structure tertiaire : Organisation spatiale des structures primaire et secondaire d’un même polypeptide, qui détermine la forme et les propriétés biologiques de la protéine.
• Structure quaternaire : Résulte de l’association de plusieurs polypeptides, appelés sous-unités, qui peuvent être identiques ou différents.

📝 Points essentiels

• Le nombre de combinaisons possibles pour une protéine constituée de n acides aminés parmi 20 est $20^n$.

• Les quatre niveaux structuraux sont:
  • la structure primaire, correspondant à l’enchaînement polypeptidique
  • la structure secondaire, correspondant à une organisation répétitive
  • la structure tertiaire, correspondant au repliement spécifique d’une chaîne
  • la structure quaternaire, correspondant à l’association de plusieurs polypeptides

• La structure primaire est la séquence peptidique codée génétiquement et elle détermine les trois autres niveaux structuraux; la conformation trans de la liaison peptidique est généralement privilégiée.

📌 L’hélice α est stabilisée par des ponts hydrogène, comporte 3,6 acides aminés par tour et est déstabilisée par la glycine et la proline, tandis que le feuillet β repose sur des ponts hydrogène entre sections d’une même chaîne ou entre chaînes distinctes.

• La structure tertiaire est stabilisée par:
  • des liaisons ioniques
  • des ponts hydrogène
  • des interactions hydrophobes
  • des ponts disulfure covalents

💡 Astuce mémo

Primaire → secondaire → tertiaire → quaternaire

📖 10. Propriétés et dénaturation protéiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Point isoélectrique : pH auquel une protéine possède une charge nette nulle.
• Dénaturation : Perte de la conformation native d’une protéine, accompagnée d’une perte de propriétés biologiques, chimiques ou physico-chimiques importantes.

📝 Points essentiels

• À un pH donné, la charge nette d’une protéine correspond à la somme des charges de ses chaînes latérales ionisables accessibles à sa périphérie.

• Une protéine devient davantage chargée lorsque le pH s’éloigne de son pI, tandis qu’elle présente une charge nette nulle au pI.

• Une faible concentration de sel augmente la solubilité des protéines par salting in, tandis qu’une forte concentration diminue leur solubilité par salting out sans dénaturer les protéines.

• Une élévation modérée de la température de 0 °C à 40 °C augmente légèrement la solubilité des protéines, tandis qu’une élévation plus forte peut provoquer une dénaturation et une précipitation par thermo-coagulation.

• 🔄 La purification après dénaturation suit trois étapes:
  1. ajout de β-mercaptoéthanol ou de DTT et d’urée
  2. dialyse dans une membrane semi-perméable avec renaturation progressive
  3. récupération de la protéine sans séparation des protéines de tailles différentes

📌 Une endopeptidase coupe une liaison peptidique à l’intérieur d’une chaîne, tandis qu’une exopeptidase coupe un acide aminé à une extrémité; l’aminopeptidase agit du côté N-terminal et la carboxypeptidase du côté C-terminal.

💡 Astuce mémo

Variation du pH, du sel ou de la température → changement de solubilité ou précipitation

📖 11. Isolement et purification des protéines

★ À maîtriser

• 🔄 L’isolement d’une protéine comprend: la lyse ou l’homogénéisation cellulaire, la centrifugation, la précipitation éventuelle, la purification par chromatographie ou électrophorèse

• La centrifugation différentielle sépare les organites selon leur vitesse de sédimentation, qui dépend de leur taille, de leur forme et de leur densité; les particules les plus grosses et les plus denses sédimentent en premier.

📌 L’ultracentrifugation zonale sépare les macromolécules selon leur vitesse de sédimentation dans un gradient de saccharose, tandis que l’ultracentrifugation isopycnique les stabilise dans une zone où leur densité égale celle du gradient.

📌 La chromatographie d’exclusion sépare les protéines selon leur taille, les petites molécules entrant dans les pores des billes et migrant plus lentement que les grandes, tandis que la chromatographie d’affinité exploite une interaction spécifique entre une protéine et un ligand immobilisé.

• En chromatographie d’affinité, la protéine cible se fixe au ligand de la résine, les impuretés sont éluées, puis la protéine est récupérée grâce à une molécule compétitive ayant une affinité pour la matrice.

Compléments

• En chromatographie par interactions hydrophobes, les protéines riches en résidus hydrophobes se fixent à une résine hydrophobe en présence de sulfate d’ammonium, puis sont éluées en diminuant sa concentration ou en ajoutant un détergent.

💡 Astuce mémo

Lyse → centrifugation → précipitation → chromatographie

📖 12. Électrophorèse SDS-PAGE

📝 Points essentiels

📌 Dans un gel non dénaturant, la migration dépend notamment de la charge des protéines, tandis que dans un SDS-PAGE le SDS rend les protéines négatives et la séparation dépend principalement de leur taille et du maillage du gel.

• Le β-mercaptoéthanol ou le DTT est ajouté au tampon de chargement du SDS-PAGE pour rompre les ponts disulfure et obtenir une dénaturation complète.

• Le système discontinu utilise:

  • un tampon Tris-glycine à pH 8,3
  • un gel de concentration en Tris-HCl à pH 6,8
  • un gel de séparation en Tris-HCl à pH 8,8

📌 Dans le gel de concentration, la glycine ralentit à pH 6,8 tandis que les ions chlorure avancent rapidement, ce qui crée une zone de forte résistance où les protéines s’entassent en une bande mince avant d’entrer dans le gel de séparation.

📌 Un pourcentage d’acrylamide plus élevé produit des pores plus petits et améliore la résolution des petites protéines, tandis que le gel de concentration contient généralement 4 ou 5 % d’acrylamide pour permettre l’entassement des protéines.

💡 Astuce mémo

Gel natif : charge et taille ; SDS-PAGE : surtout taille

📖 13. Migration en SDS-PAGE

★ À maîtriser

• 🔄 La migration suit trois étapes:
  1. La glycine anionique pousse les protéines dans le gel de concentration.
  2. À pH 6,8, la glycine devient zwittérionique et ralentit.
  3. À pH 8,8, la glycine redevient anionique, dépasse les protéines et permet leur séparation.

📌 Les protéines avancent en une mince bande devant le front des ions chlorures, tandis que la glycine progresse lentement derrière ce front dans le gel de concentration.

Compléments

• Dans le gel de concentration, les ions chlorures et les protéines forment une mince zone de forte résistance électrique, sur laquelle se concentre presque tout le voltage appliqué, habituellement 110 V.

💡 Astuce mémo

Glycine chargée → concentration des protéines → séparation selon la masse

📖 14. Coloration et analyse du gel

★ À maîtriser

• Le bleu de Coomassie se lie à toutes les protéines mais pas au gel, ce qui fait apparaître des bandes bleutées sur un fond transparent après coloration et décoloration.

• L’analyse d’un gel SDS-PAGE compare les échantillons à un standard contenant des protéines de masses connues afin d’établir une courbe d’étalonnage des poids moléculaires.

Compléments

• La coloration au bleu de Coomassie permet de détecter des quantités de protéines comprises entre 0,2 et 1 μg.

📐 Formule — Un Dalton vaut environ $1{,}7 \times 10^{-24}\ \mathrm{g}$ et correspond à $1\ \mathrm{g/mol}$.

💡 Astuce mémo

Gel coloré = présence des protéines ; standard = estimation de leur masse

📖 15. Dosage spectrophotométrique des protéines

★ À maîtriser

📌 En dosage protéique, l’absorbance est directement proportionnelle à la concentration de protéines, mais les contaminants peuvent influencer les résultats, qui restent donc des estimations.

• Le dosage des protéines utilise le tampon des échantillons comme blanc et une courbe d’étalonnage réalisée avec des quantités connues de protéines, souvent de l’albumine de sérum bovin.

📐 Formule — Pour corriger l’interférence des acides nucléiques lors de l’absorption ultraviolette, la concentration protéique se calcule par $[\mathrm{protéines\ (mg/mL)}] = 1{,}55A_{280} - 0{,}76A_{260}$.

Compléments

• La méthode de Biuret détecte les protéines à 540-550 nm et convient aux concentrations élevées de 1 à 5 mg/mL, avec un seuil minimal de 100 μg.

• La méthode de Bradford utilise le bleu de Coomassie, dont le maximum d’absorption se déplace de 465 nm à 595 nm lors de sa liaison aux protéines, et détecte environ 1 μg/mL à 1,5 mg/mL.

📖 16. Hydrolyse et composition des protéines

★ À maîtriser

• L’hydrolyse acide des protéines utilise HCl 6 N à 110 °C pendant 24, 48 et 72 heures, tandis que l’hydrolyse basique utilise NaOH 4 M à 110 °C pendant 24 heures.

📌 L’hydrolyse acide détruit le tryptophane, transforme les fonctions amides de la glutamine et de l’asparagine en glutamate et aspartate, tandis que l’hydrolyse basique détruit la sérine, la thréonine et la cystéine et peut provoquer la racémisation.

Compléments

• Après hydrolyse, les acides aminés sont séparés par chromatographie échangeuse d’ions, colorés à la ninhydrine, puis dosés par leur absorbance à 570 nm afin d’obtenir leur proportion dans la protéine.

💡 Astuce mémo

Hydrolyse acide privilégiée ; hydrolyse basique davantage destructrice

📖 17. Méthodes de séquençage protéique

★ À maîtriser

📌 Les méthodes de Sanger, du chlorure de Dansyle et d’Edman réagissent avec l’extrémité N-terminale d’un polypeptide pour identifier progressivement ses acides aminés.

• La dégradation d’Edman fait réagir le phénylisothiocyanate avec l’amine N-terminale, libère une phénylthiohydantoïne après traitement acide doux et laisse le peptide restant intact pour recommencer l’analyse.

Compléments

• Dans la méthode de Sanger, le 2,4-dinitrofluorobenzène marque l’acide aminé N-terminal, puis l’hydrolyse acide conserve la liaison entre le groupement 2,4-dinitrophényl et cet acide aminé, qui est identifié par chromatographie.

💡 Astuce mémo

Sanger, Dansyle, puis Edman pour identifier progressivement le N-terminal

📊 Tableaux de synthèse

Principes de séparation

Méthodes de purification des protéines