Fiche de révision : Technologies de l’ADN recombinant

📋 Plan du Cours

1. Principes de l’ADN recombinant
2. Vecteurs et clonage de l’ADN
3. Origines et obtention de l’ADNc
4. Étapes générales du génie génétique
5. PCR conventionnelle et amplification
6. Cinétique et analyse de la PCR

📖 1. Principes de l’ADN recombinant

🔑 Notions clés & Définitions

• ADN recombinant : Provient de la combinaison entre l’ADN d’un organisme donneur et celui d’un vecteur, qui peut appartenir à une espèce différente.
• Génie génétique : Ou technologie de l’ADN recombinant, désigne l’ensemble des techniques de construction d’un ADN recombinant et de ses utilisations.

★ À maîtriser

• L’ADN recombinant peut être utilisé pour amplifier un ADN, purifier une protéine, étudier l’expression et les fonctions d’une protéine ou localiser cette protéine dans la cellule.

Compléments

• Les cellules ayant intégré un ADN recombinant peuvent exprimer une protéine recombinante, notamment une protéine d’une autre espèce ou une protéine modifiée, mutée ou fusionnée à une étiquette fluorescente.

💡 Astuce mémo

Fragment d’intérêt + vecteur → ADN recombinant

📖 2. Vecteurs et clonage de l’ADN

🔑 Notions clés & Définitions

• Vecteur : Fragment d’ADN capable de réplication autonome qui permet d’intégrer un fragment d’ADN d’intérêt.
• Plasmide : Fragment d’ADN extrachromosomique circulaire, présent chez les bactéries et susceptible de se répliquer de façon autonome comme un chromosome accessoire.

★ À maîtriser

• Les plasmides permettent de cloner des fragments de 0,1 à 10 kb, les phages des fragments de 10 à 20 kb, les cosmides des fragments d’environ 50 kb et les YAC des fragments d’environ 500 kb.

Compléments

📌 Le clonage peut désigner une multiplication à l’identique à l’échelle cellulaire ou de l’organisme, ou l’amplification d’un fragment d’ADN inséré dans un vecteur et multiplié par des micro-organismes.

💡 Astuce mémo

Plasmide → phage → cosmide → YAC, selon la taille

📖 3. Origines et obtention de l’ADNc

★ À maîtriser

📌 L’ADN génomique contient les séquences génomiques de l’organisme, tandis que l’ADN complémentaire est obtenu à partir d’ARN messagers par transcription inverse et ne contient pas les introns de l’ADN eucaryote.

• La transcription inverse produit un ADNc à partir d’un ARNm grâce à une amorce oligo-dT, à la transcriptase reverse et aux dNTPs.

Compléments

• Après élimination de l’ARN, l’ADN polymérase I synthétise le second brin d’ADN, puis la nucléase S1 détruit la boucle simple brin pour obtenir un ADNc double brin clonable.

• Une banque d’ADNc correspond au clonage de tous les ADNc dépendant des ARNm exprimés par une cellule à un moment donné et dans des conditions données.

💡 Astuce mémo

ADN génomique avec introns ≠ ADNc sans introns

📖 4. Étapes générales du génie génétique

★ À maîtriser

• L’obtention d’un ADN recombinant comprend six étapes : origine et extraction de l’ADN donneur, amplification du fragment, présentation d’un vecteur, insertion par digestion et ligation, amplification de l’ADN recombinant, puis vérification de la construction.

Compléments

• La vérification d’une construction recombinante peut être réalisée par digestion, par PCR ou par séquençage.

💡 Astuce mémo

Extraire → amplifier → vectoriser → insérer → amplifier → vérifier

📖 5. PCR conventionnelle et amplification

🔑 Notions clés & Définitions

• PCR : Ou réaction de polymérisation en chaîne, amplifie un fragment d’ADN à partir d’amorces spécifiques, d’une ADN polymérase et de nucléotides.

★ À maîtriser

• 🔄 Un cycle de PCR conventionnelle comprend: dénaturation de l’ADN double brin à environ 95 °C, hybridation des amorces à une température dépendant de leur séquence, élongation par la Taq polymérase à 72 °C

• La Taq polymérase est une ADN polymérase provenant de Thermophilus aquaticus, et elle nécessite des dNTPs ainsi que du MgCl2 pour fonctionner.

• Après n cycles de PCR, le nombre théorique de copies d’ADN est $2^n$.

Compléments

• Les amorces de PCR mesurent généralement entre 15 et 25 nucléotides et la polymérase synthétise toujours le nouveau brin dans le sens 5’ → 3’.

💡 Astuce mémo

Dénaturation → hybridation → élongation

📖 6. Cinétique et analyse de la PCR

★ À maîtriser

📌 La PCR conventionnelle est qualitative et analysée en point final, tandis que la PCR en temps réel est quantitative et permet d’évaluer le nombre de copies d’ADN.

• La courbe de PCR en temps réel comprend:
  • une phase de latence
  • une phase exponentielle
  • une phase linéaire
  • une phase de plateau

Compléments

• La phase exponentielle débute vers le vingtième cycle et la phase de plateau apparaît généralement vers 30 à 35 cycles, lorsque les dNTPs et l’enzyme deviennent limitants et que le milieu est saturé.

• Après extraction de l’ADN et amplification par PCR, la PCR conventionnelle est révélée par électrophorèse sur un gel d’agarose contenant généralement 1 à 2 % d’agarose.

• Lors d’une électrophorèse, l’ADN chargé négativement migre de la borne moins vers la borne plus et peut être visualisé sous lumière ultraviolette après coloration au bromure d’éthidium.

💡 Astuce mémo

PCR classique qualitative ≠ PCR en temps réel quantitative

📊 Tableaux de synthèse

Vecteurs selon la taille de l’ADN

Types de PCR