Fiche de révision : Étudier le développement végétal

📋 Plan du Cours

1. Arabidopsis comme plante modèle
2. Transgenèse végétale
3. Banques et mutagenèse des plantes
4. Transposons et transposition
5. Création de mutants par transposons
6. Banques de mutants et identification
7. Modification de l’expression des gènes
8. Mutagenèse dirigée par CRISPR/Cas9
9. Principes et méthodes de l’analyse clonale
10. Cartographie des clones et imagerie

📖 1. Arabidopsis comme plante modèle

★ À maîtriser

• Arabidopsis thaliana est une petite plante à cycle de génération court, d’environ 6 semaines, qui produit 5 000 à 10 000 graines par plante.

• Le génome d’Arabidopsis thaliana mesure 125 Mb, comporte 5 chromosomes et code environ 25 500 gènes, dont certains sont dupliqués.

Compléments

• Arabidopsis thaliana appartient à la famille des Brassicaceae, qui comprend 3 200 espèces et 350 genres.

• Arabidopsis thaliana est aisément transformable et dispose de nombreux mutants ainsi que d’une carte génétique.

📖 2. Transgenèse végétale

🔑 Notions clés & Définitions

• Plante transgénique : Plante dont un ou plusieurs caractères ont été acquis par génie génétique plutôt que par transfert de gènes entre plantes parentales lors d’un croisement.

★ À maîtriser

• La transgenèse permet d’introduire dans une plante des gènes construits à volonté qui, une fois intégrés au génome, sont transmis à la descendance comme les autres gènes.

Compléments

• Une plante transgénique comporte des séquences d’ADN obtenues par des manipulations in vitro.

• Les nouveaux caractères transgéniques peuvent notamment conférer :

  • une résistance
  • une stérilité
  • la production de nouvelles protéines

• Dans le plasmide Ti, l’ADNt est la séquence transférée à la cellule hôte et est bordé par de courtes séquences répétées.

• Les vecteurs désarmés sont débarrassés des séquences oncogènes et des gènes de synthèse des opines, puis portent le gène d’intérêt et un marqueur de sélection.

📖 3. Banques et mutagenèse des plantes

★ À maîtriser

• 🔄 La démarche de génétique fondée sur une banque de mutants suit ces étapes :

  1. Créer la banque de mutants
  2. Cribler les individus pour un phénotype particulier
  3. Identifier les mutants d’intérêt
  4. Caractériser leurs mutations

• Après mutagenèse chimique sur graine, la plante M1 est chimérique car la mutation touche une cellule de l’embryon à l’état hétérozygote; si cette cellule ou ses descendantes contribuent à la lignée germinale, des graines portent la mutation, et l’autofécondation fait apparaître des homozygotes en M2. - Page and Grossniklaus, 2002

• La mutagenèse par insertion consiste à provoquer l’insertion d’une séquence d’ADN étrangère, telle qu’un ADN-T ou un transposon, dans le génome; l’insertion peut empêcher la production de la protéine et modifier le phénotype.

Compléments

• L’éthyl méthyl sulfonate (EMS) est un agent mutagène chimique utilisé pour produire des mutations chez les plantes, notamment des substitutions ponctuelles GC vers AT.

• En pratique, le criblage de banques de mutants d’Arabidopsis thaliana s’appuie souvent sur l’analyse de 2 000 à 3 000 plantes M1. - Page and Grossniklaus, 2002

💡 Astuce mémo

Mutagénèse → criblage → identification → caractérisation

📖 4. Transposons et transposition

🔑 Notions clés & Définitions

• Transposon : Séquence d’ADN capable de se déplacer d’un site à un autre au sein d’un génome.

★ À maîtriser

• Les rétrotransposons de classe 1 passent par une étape de transcription inverse, tandis que les transposons à ADN de classe 2 n’en comportent pas. - Bourque et al, 2018

• La transposition des rétrotransposons de classe 1 suit un mécanisme de copie-colle avec un intermédiaire ARN, tandis que celle des transposons à ADN de classe 2 suit un mécanisme de coupe-colle avec un intermédiaire ADN. - Lisch et al, 2013

• Un transposon autonome peut assurer sa propre transposition, tandis qu’un transposon non autonome dépend d’éléments autonomes; chez les éléments du maïs, Ac est autonome et Ds, dérivé de Ac, ne l’est pas.

Compléments

• Barbara McClintock a mis en évidence les transposons chez le maïs dans les années 1940-1950 et a proposé dès 1940 que le génome n’est pas une structure statique; son idée n’a été acceptée qu’après la découverte des transposons bactériens en 1970.

• Chez le maïs, l’insertion de Ds dans le gène coloré C rend le tissu incolore; si Ds se transpose tôt et rétablit C, un grand secteur coloré apparaît, tandis qu’une transposition tardive produit des secteurs plus petits.

• Les hélitrons constituent une autre classe de transposons; leur mécanisme de transposition, incomplètement décrit, pourrait impliquer un mécanisme de cercle roulant.

• Selon les espèces, les transposons représentent 15 % à 75 % du génome; ils constituent environ 50 % des génomes humain, chimpanzé, souris et singe, 75 % du génome du maïs, 85 % de celui de l’orge et 98 % de celui de l’iris. - Negi and Penna, 2016

• Les plantes possèdent de nombreuses familles de transposons, chacune comprenant des éléments autonomes et non autonomes, et la majorité des éléments sont des reliques non autonomes.

• La méthylation de l’ADN de l’hôte inhibe le déplacement des transposons.

💡 Astuce mémo

Rétrotransposon : copie-colle via ARN ; transposon à ADN : coupe-colle

📖 5. Création de mutants par transposons

★ À maîtriser

• La stratégie « Two-element transposon tagging » utilise deux lignées parentales transgéniques : l’une porte le gène de sélection négative IAAH et un Ac incomplet produisant la transposase, et l’autre porte IAAH ainsi qu’un Ds non autonome muni du gène NPTII de résistance à la kanamycine. - Page and Grossniklaus, 2002

• Après croisement des deux lignées parentales, la descendance hétérozygote porte les transposons et les marqueurs; la transposase produite par Ac mobilise Ds. - Page and Grossniklaus, 2002

• Après autofécondation, la sélection des plantes ayant perdu Ac élimine la source de transposase et stabilise le génome, tandis que la sélection de celles ayant perdu le Ds initial permet de retenir les plantes où Ds s’est inséré à un nouveau site; ces plantes F2 forment une population de mutants d’insertion. - Page and Grossniklaus, 2002

• Pour isoler les mutants d’insertion, on contre-sélectionne les plantes portant le gène IAAH en ajoutant du NAM, puis on sélectionne les plantes résistantes à la kanamycine en ajoutant de la Kan.

Compléments

• Dans cette stratégie, le gène IAAH convertit le NAM en NAA, ce qui entraîne la mort des plantes exprimant IAAH en présence de NAM. - Page and Grossniklaus, 2002

💡 Astuce mémo

Ac fournit la transposase, Ds saute, puis la perte d’Ac stabilise l’insertion

📖 6. Banques de mutants et identification

★ À maîtriser

📌 La mutagenèse par insertion peut utiliser l’ADN de transfert issu de la bactérie Agrobacterium tumefaciens ou des transposons ; l’utilisation de l’ADN de transfert nécessite la transgenèse végétale.

Compléments

• Un gène simple peut être identifié parce qu’il est étiqueté par l’ADN inséré, notamment par PCR ou par plasmid rescue.

• L’identification d’un gène complexe peut s’appuyer sur :

  • une carte génétique
  • des marqueurs moléculaires
  • la marche sur le chromosome

📖 7. Modification de l’expression des gènes

★ À maîtriser

📌 La modification de l’expression du gène endogène repose sur deux stratégies complémentaires : la surexpression augmente la quantité de protéine produite, tandis que les stratégies antisens ou RNAi réduisent l’expression.

• Dans la stratégie RNAi, un ARN en épingle à cheveux est fragmenté par DICER en siARN, dont un brin guide le complexe RISC vers les ARN complémentaires, que RISC dégrade.

Compléments

• Un transgène de surexpression place l’ADNc du gène d’intérêt sous le contrôle d’un promoteur fort, tel que le promoteur 35S, et comprend une séquence de résistance à un antibiotique pour sélectionner les plantes transformées.

• Le promoteur 35S provient du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) et est décrit comme fort, constitutif et reconnu par l’ARN polymérase II. - Haas et al, 2002

• Dans la stratégie antisens, une séquence d’ADNc du gène d’intérêt orientée en antisens produit un ARN capable de s’hybrider à l’ARNm du gène endogène et de réduire son expression.

• Une limite de la surexpression est qu’une protéine produite dans un contexte non naturel peut ne pas assurer sa fonction.

💡 Astuce mémo

Surexpression : plus de protéine ; antisens ou RNAi : moins

📖 8. Mutagenèse dirigée par CRISPR/Cas9

🔑 Notions clés & Définitions

• Cas9 : Endonucléase guidée par un ARN.

★ À maîtriser

• La technologie CRISPR/Cas9, développée depuis 2012, permet de réaliser une mutagenèse dirigée chez les plantes.

📌 Le site de coupure de Cas9 dépend de la complémentarité entre l’ARN guide et la séquence cible, ainsi que de l’interaction de Cas9 avec un motif PAM ; pour la Cas9 la plus utilisée, le PAM est NGG.

Compléments

• Le prix Nobel de chimie 2020 a été attribué à Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna.

• Une Cas9 modifiée, appelée nCas9, coupe un seul brin ; la réparation par le système de l’hôte peut servir à effectuer une mutagenèse ponctuelle spécifique ou à remplacer une séquence d’ADN par une séquence choisie.

• CRISPR/Cas9 peut produire des plantes sans transgène, notamment après élimination du système CRISPR par ségrégation.

• Les modifications génétiques peuvent être difficiles à analyser dans les familles multigéniques, en cas de modifications létales ou d’effets pléiotropes, ou lorsque la plante compense une voie de régulation désactivée en stimulant une voie parallèle.

📖 9. Principes et méthodes de l’analyse clonale

🔑 Notions clés & Définitions

• Analyse clonale : Marquage d’une cellule somatique par une mutation de façon que les cellules mutées soient visuellement distinguables des cellules non mutées.

★ À maîtriser

• L’analyse clonale permet d’identifier les cellules dérivant d’une même cellule mère et d’étudier la distribution et l’orientation des divisions cellulaires dans un organe.

Compléments

• Une méthode de marquage clonal consiste à utiliser la colchicine pour induire des polyploïdisations, créant des tissus dont la ploïdie permet de les distinguer. - Kerns and Collins, 1947

• Dans une autre méthode, l’irradiation d’une plante hétérozygote pour une mutation visible peut supprimer l’allèle sauvage et révéler des secteurs au phénotype mutant, par exemple des secteurs jaunes en cas de déficience de production de chlorophylle ou d’anthocyanes. - Poethig and Sussex, 1985

• Le marquage clonal de plantes transgéniques peut utiliser des transposons ou une recombinase spécifique de site, telle que le système Cre-Lox, pour induire aléatoirement l’expression d’un gène marqueur dans une cellule. - Franck and Chitwood, 2016

📖 10. Cartographie des clones et imagerie

★ À maîtriser

• L’analyse clonale repose sur la production et l’analyse de chimères.

Compléments

• Chez le maïs, l’analyse de secteurs non pigmentés après irradiation a permis d’étudier le devenir des cellules du méristème apical caulinaire ; un secteur observé pouvait mesurer quatre entre-nœuds et représenter un huitième de la circonférence de la tige.

• L’imagerie en direct au microscope confocal permet d’observer une plante en développement.

• Dans l’analyse du développement des anthères d’Arabidopsis thaliana, le primordium de l’étamine débute à partir de 28 ± 2 cellules épidermiques. - Silveira et al, 2021

📊 Tableaux de synthèse

Classes principales de transposons