★ À maîtriser
L'ADN est une double hélice dont les deux brins associent toujours l'adénine à la thymine et la guanine à la cytosine.
Pendant la réplication, les deux brins d'ADN se séparent et chacun sert de matrice à la synthèse d'un brin complémentaire, assurant le transfert fidèle de l'information aux cellules-filles.
🔄 L'expression d'un gène suit ces étapes :
La traduction a lieu sur le ribosome et produit un polypeptide dont la succession d'acides aminés détermine la structure tridimensionnelle de la protéine et, par conséquent, sa fonction.
Le code génétique associe chaque acide aminé à un codon de trois nucléotides ; 64 triplets sont possibles et plusieurs codons peuvent spécifier le même acide aminé, ce qui rend le code dégénéré.
Une mutation ponctuelle substituant un acide glutamique par une valine dans l'hémoglobine peut provoquer la drépanocytose : la protéine polymérise en fibres, déforme les globules rouges en faucille et peut bloquer les capillaires.
Compléments
Chez les eucaryotes, les chromosomes sont contenus dans un noyau délimité par une membrane, absente chez les procaryotes, dont les gènes sont généralement rassemblés sur un chromosome circulaire.
Les correspondances ADN-ARN sont :
ADN → ARN → protéine
★ À maîtriser
📌 La mitose produit deux cellules-filles ayant le même nombre de chromosomes que la cellule mère, tandis que la méiose produit quatre cellules-filles haploïdes à partir d'une cellule diploïde.
Pendant la méiose, les chromosomes parentaux sont distribués aléatoirement et indépendamment entre les cellules-filles, et le crossing-over échange des fragments entre chromosomes homologues.
Plus deux gènes sont éloignés sur un même chromosome, plus la probabilité de recombinaison entre eux est élevée ; les fréquences de recombinaison permettent d'inférer leurs distances relatives et leur ordre.
📌 Dans un croisement de lignées pures différant par un seul caractère, tous les hybrides F1 présentent la forme dominante ; la forme non exprimée est récessive, notée par convention avec une lettre minuscule.
📌 La loi d'assortiment indépendant prédit que des caractères parentaux différents se transmettent indépendamment et produisent toutes les combinaisons possibles, lorsque les gènes sont sur des chromosomes différents ou suffisamment éloignés sur un même chromosome.
Compléments
La fécondation fusionne les noyaux des gamètes mâle et femelle pour former un zygote diploïde portant des chromosomes d'origine maternelle et paternelle ; les mâles ne possèdent qu'une copie de chacun des chromosomes sexuels X et Y.
En 1866, Gregor Mendel publie ses expériences sur la transmission héréditaire des caractères chez le pois et en tire trois lois : uniformité en F1, ségrégation des caractères et assortiment indépendant.
Pour ses expériences, Mendel choisit le pois, des caractères qualitatifs discontinus et observables, ainsi que des souches pures ; il étudie sept caractères ayant chacun deux formes distinctes.
En F3, les individus F2 récessifs aa ne produisent que des descendants récessifs, tandis que parmi les individus dominants F2, un tiers est homozygote AA et deux tiers sont hétérozygotes Aa.
Les limites principales des observations mendéliennes sont :
Mitose conserve la ploïdie ; méiose la réduit de moitié
★ À maîtriser
📌 La sélection génétique classique repère les individus par leur phénotype et les croise sans connaître nécessairement les gènes impliqués, tandis que la transgenèse introduit de façon ciblée un gène isolé et identifié.
📌 La définition rigoureuse de la fonction d'un gène nécessite d'examiner à la fois le phénotype de perte de fonction, qui teste si le gène est nécessaire, et le phénotype de gain de fonction, qui teste s'il est suffisant ou déterminant.
Compléments
La sélection naturelle est un moteur de l'évolution des espèces et de leurs génomes, tandis que la sélection de mutants est un moyen humain de générer et de faire évoluer la diversité plus rapidement et à plus grande échelle que les processus naturels.
Les objectifs de la transgenèse végétale comprennent :
Les applications animales évoquées comprennent :
Les porcs transgéniques Enviropig expriment le gène de la phytase et rejettent moins de phosphate dans leurs déjections.
La transgenèse animale reste moins développée que la transgenèse végétale, car ses coûts de développement sont élevés et la maîtrise de la dissémination des animaux dans l'environnement demeure imparfaite.
Les animaux transgéniques servent à étudier le rôle des gènes in vivo, à créer des modèles de maladies humaines, à produire des protéines recombinantes, à préparer des organes pour la transplantation, à lutter contre des maladies et à améliorer des caractéristiques zootechniques.
Chez la drosophile, la perte de fonction des gènes proneuraux achaete et scute supprime les soies sensorielles, tandis que leur expression renforcée produit des soies excédentaires.
Les risques potentiels des OGM comprennent la toxicité et les allergies liées au gène inséré, les effets de produits dérivés d'animaux nourris aux OGM, les résistances aux antibiotiques, la baisse de valeur nutritive, les effets imprévisibles et l'impact sur la biodiversité ou la dissémination environnementale.
L'évaluation comprend :
Sélection observe le phénotype ; transgenèse cible un gène identifié
★ À maîtriser
La souris est utilisée comme modèle notamment parce qu'elle est petite, se reproduit rapidement, atteint la maturité sexuelle vers six semaines, supporte la captivité, possède un génome séquencé et permet des modifications génétiques ciblées ou additionnelles.
Le génome murin comprend environ 3 × 10⁹ paires de bases, plus de 30 000 gènes et 20 paires de chromosomes ; environ 1 à 2 % de l'ADN code des protéines.
📌 La micro-injection d'ADN dans le pronucléus entraîne une insertion aléatoire et produit des souris transgéniques, tandis que le ciblage par recombinaison homologue dans des cellules ES produit des souris knock-out.
Compléments
La gestation de la souris dure 19 à 21 jours, une portée compte 6 à 15 souriceaux et le temps de génération est d'environ 10 semaines, soit environ cinq générations par an.
Les souris de laboratoire descendent de Mus musculus et de sous-espèces différenciées géographiquement, puis domestiquées et sélectionnées ; les grandes lignées consanguines incluent C57BL/6, BALB/c, DBA/2, C3H et 129.
🔄 Le développement précoce suit cette séquence :
La production d'une souris transgénique par micro-injection d'ADN prend environ trois mois, tandis que la méthode classique par cellules ES et recombinaison homologue prend environ deux ans, délai réduit à quelques mois avec CRISPR/Cas9.
Le clonage par transfert nucléaire consiste à injecter un noyau somatique dans un ovocyte énucléé afin de reconstituer un individu génétiquement identique au donneur du noyau.
Dans les lignées consanguines, la proportion du génome homozygote atteint environ 50 % après deux générations, 75 à 80 % après huit générations et plus de 98 % après vingt générations de consanguinité. - Silver, 1995
★ À maîtriser
Pour détecter une différence de 4 minutes avec une puissance statistique de 80 %, il faut 12 souris consanguines contre 180 souris non consanguines.
Avec 20 souris, la puissance de détection d'une différence de 4 minutes est de 97 % chez les souris consanguines et de 14 % chez les souris non consanguines.
📌 Un même allèle mutant peut entraîner des phénotypes différents selon le fond génétique sur lequel il est exprimé.
📌 Le fond génétique doit être choisi comme un élément du design expérimental et précisément documenté dans toute publication ou tout compte-rendu d'expérience.
Compléments
Dans l'exemple du sommeil induit par l'hexobarbital, les souris consanguines présentent un écart-type d'environ 3,2 minutes, contre 13,5 minutes pour deux stocks non consanguins.
Les stocks non consanguins restent utilisés parce qu'ils offrent une résolution génétique plus fine et une variabilité plus proche de celle de l'Homme, malgré une composition génétique parfois mal connue ou contrôlée et la possibilité de mutations récessives délétères.
La mutation diabetes (db) ou obese (ob) est associée à l'obésité sur fond C57BL/6 et au diabète sur fond C57BL/Ks.
La mutation Min produit environ 6 polypes sur fond (B6×AKR)F1 et environ 30 tumeurs intestinales sur fond C57BL/6.
Le knock-out d'EGF-R permet une survie jusqu'à 3 semaines sur fond CD-1, mais entraîne une mort à l'implantation sur fond CF-1.
La déficience en ferrochélatase entraîne des tableaux cliniques différents selon la souche receveuse BALB/c, C57BL/6 ou SJL, notamment pour l'anémie, l'ictère, l'accumulation hépatique de protoporphyrine et l'hépatite chronique.
Consanguines : faible dispersion ; non consanguines : forte dispersion
★ À maîtriser
📌 Les souris se reproduisent mieux entre 16 et 26 °C et avec une humidité comprise entre 40 et 60 %.
Le cycle œstral de la souris dure 4 à 5 jours, avec ovulation le troisième jour, et placer les femelles avec un mâle ce jour-là maximise les grossesses obtenues.
Un bouchon copulatoire indique qu'un accouplement a eu lieu dans les 8 à 30 heures précédentes, mais ne confirme pas la conception.
Compléments
La reproduction des souris est influencée par : les défauts de naissance, la vigueur des hybrides, la durée de vie reproductive, le comportement de souche, les mutations et transgènes, la température et l'humidité, la lumière, le bruit et les vibrations, la pression barométrique, les odeurs, la manipulation, la nutrition, le placement des mangeoires et l'état de santé
Les mâles SJL/J peuvent attaquer leurs compagnons de cage et leur descendance, les femelles NZB/BlNJ sont peu attentives à leur portée et les femelles C57BL/6J perdent fréquemment leur première portée.
Les mutations peuvent être létales au stade embryonnaire, réduire ou supprimer la fertilité, ou affecter la fonction de la glande mammaire.
Un cycle uniforme et ininterrompu de 14 heures de lumière et 10 heures d'obscurité améliore généralement les performances d'élevage des souris, qui se reproduisent principalement la nuit.
Le co-logement dense supprime les cycles œstriens des femelles et l'introduction d'un mâle ou l'exposition à des phéromones ou androgènes mâles les fait reprendre de façon synchronisée, effet Whitten décrit par The Jackson Laboratory en 1976.
La grossesse peut être confirmée par palpation à partir du 11ᵉ jour de gestation, le jour 0 correspondant au jour de découverte du bouchon copulatoire.
★ À maîtriser
Le choix du schéma d'élevage d'une souche mutante dépend de la viabilité et de la fertilité des homozygotes, de la méthode de génotypage disponible et des souris de contrôle nécessaires.
Le croisement homozygote mutant × homozygote mutant est utilisable si les deux sexes homozygotes sont viables et fertiles et produit 100 % d'homozygotes, sans génotypage systématique des souriceaux.
Le croisement hétérozygote × homozygote mutant est utilisé lorsqu'un seul des deux génotypes homozygotes est viable ou fertile et produit 50 % d'homozygotes et 50 % d'hétérozygotes.
Le croisement hétérozygote × hétérozygote est requis lorsque les homozygotes mutants sont sévèrement atteints, stériles ou meurent avant la maturité sexuelle et produit 25 % d'homozygotes mutants, 50 % d'hétérozygotes et 25 % de sauvages.
Si l'homozygotie pour un transgène est létale ou délétère, la souche est maintenue par croisement Tg/0 × 0/0, qui produit environ 50 % d'hétérozygotes et 50 % de sauvages.
Compléments
Pour limiter la dérive génétique, il est recommandé de rétrocroiser une lignée homozygote × homozygote à la souche parentale, ou à l'hybride F1 de référence sur fond mixte, environ toutes les 10 générations.
Un test de progéniture détermine le génotype inconnu en accouplant l'animal avec un individu de génotype connu, souvent homozygote récessif, puis en comparant les phénotypes de la descendance aux proportions attendues.
Dans l'exemple de la mutation récessive beige, une souris noire croisée avec une souris beige homozygote donne uniquement des descendants noirs si elle est sauvage, tandis qu'une descendance comprenant des souris beiges révèle qu'elle est hétérozygote.
📌 Si l'homozygotie pour un transgène est viable, le croisement Tg/0 × Tg/0 peut être utilisé, mais il faut distinguer homozygotes et hétérozygotes par génotypage, test de descendance ou PCR quantitative du nombre de copies.
Le maintien d'une souche F1 issue de deux souches parentales différentes nécessite généralement trois colonies parallèles : les deux souches parentales et la souche F1 souhaitée.
Le maintien d'une souche Cre-lox nécessite généralement trois colonies : une souche Cre, une souche lox portant le gène flanqué de sites loxP, et la souche double Cre-lox.
La cryoconservation économise de l'espace et des coûts de maintien, protège contre les pertes imprévues, peut assainir une colonie, ralentit la dérive génétique et réduit le risque de variation du nombre de copies d'un transgène.
📌 Une petite colonie doit conserver au minimum six couples reproducteurs de générations différentes, maintenir deux ou trois générations en parallèle et garder les reproducteurs âgés de 2 à 8 mois.
★ À maîtriser
📌 La microinjection d'ADN produit une transgenèse additionnelle par insertion aléatoire, tandis que les cellules ES recombinantes permettent une modification ciblée par recombinaison homologue, notamment un KO, un KI ou une mutation ponctuelle.
📌 Dans une construction transgénique, le promoteur détermine où et quand le gène est exprimé, tandis que la séquence codante détermine ce qui est produit.
Les trois stratégies sont :
L’intégration aléatoire d’un transgène peut provoquer des insertions multiples et une surexpression non physiologique, l’interruption d’un gène essentiel pouvant être létale, la destruction d’un gène endogène ou un effet de position sur l’expression.
📌 Comparer plusieurs lignées indépendantes permet d’attribuer au transgène un phénotype observé dans toutes les lignées, tandis qu’un phénotype propre à une seule lignée est probablement un artefact d’insertion.
Compléments
La construction de transgenèse comporte notamment des régions régulatrices, une région transcrite comprenant exons et introns, des codons d'initiation et d'arrêt, des régions 5'UTR et 3'UTR et un signal de polyadénylation.
La microinjection d'ADN produit des souris transgéniques en environ 3 mois, tandis que la stratégie utilisant des cellules ES produit des souris KO ou KI via des chimères en environ 2 ans.
La microinjection pronucléaire, méthode historique mise au point en 1980, sert à ajouter un transgène sans ciblage, notamment pour obtenir des souris surexprimant un gène, rapporteurs ou exprimant Cre sous un promoteur donné.
📌 La PMSG mime principalement l’activité FSH tout en ayant aussi une activité LH, tandis que l’hCG mime l’activité LH ; ces hormones ne sont pas identiques à la FSH et à la LH.
Zygote → cellules ES ou microinjection → animal modifié
★ À maîtriser
📌 La microinjection classique produit une insertion aléatoire, tandis que les modifications KO ou KI par recombinaison homologue ciblent le locus voulu.
La sélection positive-négative enrichit les cellules recombinées : G418 élimine les cellules sans Neo, puis le ganciclovir élimine les cellules TK positives ; la recombinaison homologue conserve Neo mais perd la TK située hors des bras d’homologie.
CRISPR/Cas9, dont l’édition du génome a transformé les pratiques à partir de 2012-2013, utilise un ARN guide et Cas9 pour couper l’ADN au site désigné.
📌 Après une coupure double brin par CRISPR/Cas9, la réparation par NHEJ produit de petites insertions ou délétions pouvant inactiver le gène, tandis que la réparation par HDR avec une matrice permet un knock-in ou une mutation précise.
Compléments
📌 La couleur du pelage permet de repérer les chimères : les cellules ES et les cellules du blastocyste proviennent de souches à phénotypes visibles différents, et les zones pigmentées identifient la contribution des cellules ES dans l’exemple d’un blastocyste albinos.
Pour cloner Dolly, le noyau d’une cellule de mamelle d’une brebis A est fusionné par choc électrique avec un ovocyte énucléé d’une brebis B, puis l’embryon est transféré dans l’utérus d’une brebis porteuse C ; l’agneau est génétiquement celui de A, sauf pour l’ADN mitochondrial issu de l’ovocyte.
La transfection et la sélection de cellules somatiques en culture avant transfert de leur noyau dans un ovocyte énucléé permettent de caractériser la modification avant la production de l’animal et d’éviter l’incertitude liée à une intégration aléatoire.
📌 Dans une sélection positive-négative, Neo confère la résistance à la néomycine ou au G418 et constitue le marqueur positif, tandis que HSV-TK rend les cellules sensibles au ganciclovir et constitue le marqueur négatif.
Microinjection aléatoire ; recombinaison homologue ciblée.
★ À maîtriser
📌 Avec Cre-lox, deux sites loxP de même orientation sur un chromosome entraînent une délétion, des sites d’orientation opposée sur un chromosome entraînent une inversion, et des sites situés sur deux chromosomes différents peuvent entraîner une translocation réciproque.
Un KO conditionnel hépatique s’obtient en croisant une souris floxée homozygote avec une souris exprimant Cre sous le promoteur de l’albumine, puis en rétrocroisant un descendant Cre positif floxé hétérozygote avec une souris floxée homozygote ; 25 % de la descendance est Alb-Cre ; loxP/loxP et présente l’excision dans le foie.
Dans un KO conditionnel hépatique Alb-Cre ; loxP/loxP, les deux allèles du gène sont excisés dans le foie tandis que le gène reste fonctionnel dans les autres tissus.
Dans le système CreER, le tamoxifène, ou son métabolite actif 4-OHT, libère la Cre fusionnée à un domaine de récepteur hormonal et retenue dans le cytoplasme ; la Cre entre alors dans le noyau et excise la séquence floxée.
La règle des 3R, formulée par Russell et Burch en 1959, consiste à Remplacer, Réduire et Raffiner l’expérimentation animale.
Compléments
📌 Les systèmes Tet-On et Tet-Off peuvent activer ou éteindre un transgène de façon réversible avec la doxycycline, tandis que l’excision par Cre-lox est définitive.
Les précautions liées à Cre comprennent le contrôle du mosaïcisme et de l’expression dans des tissus inattendus, l’évaluation de l’efficacité de recombinaison, le contrôle d’une toxicité propre à Cre et la comparaison d’animaux de même fond génétique.
Dans une lignée rapporteur Lox-Stop-Lox, la cassette STOP bloque le rapporteur en l’absence de Cre ; dans les cellules où Cre est active, elle est excisée et le rapporteur s’exprime, révélant où et quand Cre agit.
La directive européenne 2010/63/UE encadre la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et a été transposée en France par le décret du 1er février 2013.
📌 Tout projet utilisant des animaux vivants doit obtenir une autorisation ministérielle après évaluation par un comité d’éthique en expérimentation animale et examen de sa conformité aux 3R et de la sévérité des procédures.
Cre-lox règle le lieu ; CreER et tamoxifène ajoutent le moment.
★ À maîtriser
📌 La transduction, ou infection, transfère des acides nucléiques au moyen d’un vecteur viral, tandis que la transfection repose sur une méthode non virale.
📌 Une transfection transitoire maintient l’ADN sous forme d’épisome non intégré et son expression diminue par dilution ou perte lors des divisions, tandis qu’une transfection stable intègre l’ADN au génome et le transmet aux cellules filles.
Compléments
📌 Une transfection stable n’est transmise à la descendance de l’animal que si l’intégration concerne la lignée germinale, alors qu’une intégration dans des cellules somatiques ne crée pas une transmission héréditaire.
La transfection transitoire dure de quelques jours à plusieurs mois selon la capacité de division cellulaire ; dans les cellules épithéliales à renouvellement rapide, elle peut disparaître en une quinzaine de jours.
Les premières souris transgéniques obtenues par microinjection pronucléaire ont été produites par Gordon et ses collaborateurs en 1980. - Gordon et collaborateurs
La transfection in vivo permet de tester une hypothèse directement dans l’organisme sans créer de lignée transgénique, avec un gain de temps, une réduction du nombre d’animaux et la possibilité de cibler un organe ou un stade du développement.
Transfection non virale, transduction virale
★ À maîtriser
📌 Un promoteur fort et ubiquitaire, comme CMV, CAG ou EF1α, permet l’expression dans toutes les cellules transfectées, tandis qu’un promoteur spécifique restreint l’expression à un type cellulaire ciblé.
📌 Une complémentarité parfaite entre le brin guide et l’ARNm, caractéristique des siRNA, conduit au clivage de l’ARNm, tandis qu’une complémentarité partielle, courante pour les miRNA animaux, réprime la traduction et déstabilise l’ARNm.
Compléments
📌 Un siRNA est un duplex synthétique d’environ 21 nucléotides chargé directement dans RISC et généralement transitoire, tandis qu’un shRNA est exprimé en épingle à cheveux puis clivé par Dicer et peut produire un effet prolongé s’il est intégré par un lentivirus.
Les précautions expérimentales liées à l’ARN interférence comprennent les effets hors cible, la toxicité due à la saturation de la machinerie endogène par un shRNA trop exprimé et la réponse immunitaire innée aux ARN double brin ; un contrôle non ciblant et, idéalement, plusieurs séquences ciblant le même gène sont utilisés.
Une méthode idéale associe :
Le choix expérimental prend aussi en compte la possibilité de réaliser l’expérience in vitro ou ex vivo au titre du Remplacement, l’invasivité et la sévérité pour l’animal, les moyens disponibles et le niveau de confinement requis pour les virus.
La capacité de l’AAV est d’environ 5 kb, ce qui constitue une contrainte de taille pour le matériel à délivrer.
pri-miRNA → pré-miRNA → duplex → RISC
★ À maîtriser
Les méthodes chimiques associent les acides nucléiques chargés négativement à des molécules cationiques, qui forment des complexes interagissant avec la membrane cellulaire puis internalisés le plus souvent par endocytose.
La lipofection forme des lipoplexes en mélangeant un acide nucléique et des liposomes cationiques ; ceux-ci interagissent avec les protéoglycanes anioniques de la surface cellulaire avant leur internalisation par endocytose.
Après une injection intraveineuse d’in vivo-jetPEI, l’expression est principalement pulmonaire, mais elle est aussi détectable dans le foie, la rate, les reins, le pancréas, le cœur, la vessie et les artères.
Après injection intraveineuse, le signal pulmonaire est environ 100 à 500 fois supérieur à celui du foie, de la rate ou du rein.
Compléments
📌 Après endocytose d’un lipoplexe, la maturation vers le lysosome entraîne la fragmentation de l’ADN, tandis que l’échappement de l’endosome permet à l’ADN de gagner le noyau et d’être exprimé.
La lipofection est simple et utilisable in vitro comme in vivo, mais son efficacité varie, sa reproductibilité est faible et, in vivo, les protéines sériques peuvent l’inactiver ; une forte dose peut provoquer une inflammation.
Le phosphate de calcium forme avec l’ADN de fins co-précipités internalisés par endocytose ou phagocytose ; cette méthode est sensible au pH et à la taille du précipité, toxique, peu efficace (environ 5 %) et utilisable uniquement in vitro.
Après endocytose, les amines du PEI tamponnent l’acidification de l’endosome, favorisent l’entrée de protons, d’ions chlorure et d’eau, puis le gonflement osmotique provoque la rupture de la vésicule et la libération du complexe.
L’in vivo-jetPEI se prépare en diluant séparément l’acide nucléique et le réactif dans du glucose à 5 %, puis en les mélangeant, en vortexant et en incubant environ 15 minutes à température ambiante avant l’injection.
Les complexes acide nucléique/in vivo-jetPEI restent stables au moins 24 h à température ambiante, à 4 °C et à 37 °C, sans former d’agrégats.
Le protocole in vivo-jetPEI a été adapté à de nombreuses espèces animales, notamment le rat, le cobaye, le hamster, le chien, le lapin, le singe, le mouton, la vache, le poulet, le poisson-zèbre, des mollusques et le moustique.
L’expression après administration d’in vivo-jetPEI dépend de la voie, du rapport de charge, de la dose et du tampon.
Complexation des acides nucléiques → interaction cellulaire → endocytose
★ À maîtriser
🔄 La laserfection se déroule ainsi : le laser perméabilise transitoirement la membrane, l’ADN entre par les pores sous l’effet de la pression osmotique et de la diffusion, les pores se referment
La magnétofection associe l’ADN à des nanoparticules magnétiques, puis un aimant placé près de l’organe cible attire les complexes et favorise leur internalisation par les cellules.
En microinjection, une pipette de verre très fine introduit l’acide nucléique directement dans le cytoplasme ou le noyau d’une cellule à la fois, sous microscope.
Pour produire un animal transgénique par microinjection, le transgène est injecté dans un pronucléus de zygote, les embryons sont réimplantés chez une femelle pseudo-gestante, puis les petits fondateurs sont génotypés.
La sonoporation utilise des ultrasons, souvent associés à des microbulles gazeuses, dont la cavitation perméabilise transitoirement les membranes afin que l’ADN entre dans les cellules avant leur refermeture.
🔄 L’électroporation suit ces étapes : les impulsions déstabilisent la membrane et créent des pores, l’ADN migre vers l’anode et traverse les pores, à l’arrêt du champ, la membrane se referme
Lors d’une électroporation in utero chez la souris, la femelle gestante est anesthésiée et opérée, l’ADN mélangé au Fast Green est microinjecté dans un ventricule latéral embryonnaire, des impulsions sont appliquées avec l’anode du côté de la région cible, puis l’utérus est remis en place et l’abdomen suturé.
Compléments
🔄 La préparation des cartouches suit ces étapes :
La biolistique est très utilisée en physiologie végétale pour transformer des protoplastes ou des tissus, puis régénérer des plantes, et peut aussi viser des tissus animaux superficiels ou des organes exposés chirurgicalement.
📌 La biolistique permet une co-transfection simple de plusieurs plasmides, mais sa pénétration reste limitée aux tissus superficiels et son efficacité est faible.
📌 Un champ électrique trop intense provoque une électroporation irréversible et la mort cellulaire.
Pour l’électroporation in utero, un ordre de grandeur classique est d’environ 5 impulsions de 35 à 50 V, durant 50 ms à 1 Hz, avec des paramètres à adapter au protocole.
L’électroporation in utero transfecte les progéniteurs neuraux bordant le ventricule ; le plasmide épisomique se dilue dans les cellules qui se divisent, tandis que les neurones post-mitotiques formés peu après peuvent conserver le signal pendant des mois.
Le plasmide CAG-RFP associe un promoteur CAG fort et ubiquitaire à la protéine fluorescente rouge RFP.
★ À maîtriser
La transfection hydrodynamique consiste à injecter très rapidement dans la veine caudale une solution saline contenant de l’ADN plasmidique, en un volume égal à 10 % du poids de l’animal, afin de produire une forte pression hydrodynamique.
Le grand volume injecté dépasse le débit cardiaque, provoque un reflux par la veine cave inférieure vers les veines hépatiques et ouvre transitoirement des pores dans l’endothélium sinusoïdal et la membrane des hépatocytes, permettant l’entrée de l’ADN.
La transfection hydrodynamique permet de transfecter 10 à 40 % des hépatocytes.
📌 Les rétrovirus et les lentivirus s’intègrent au génome et permettent une expression stable transmise aux cellules filles, tandis que l’adénovirus s’exprime de façon transitoire à partir d’un génome épisomal.
Compléments
📌 Pour réussir une transfection hydrodynamique, le volume et la vitesse d’injection sont critiques : une injection trop lente ou un volume inférieur à 10 % du poids de l’animal ne transfecte pas les cellules.
🔄 La particule virale suit ces étapes : elle se fixe à des récepteurs cellulaires, elle est internalisée, elle libère le génome recombinant dans la cellule
Les capacités d’insert indiquées sont d’environ 8 kb pour les rétrovirus, 9 kb pour les lentivirus, 8 kb pour les adénovirus, 5 kb pour les AAV, 30 à 40 kb pour HSV et 25 kb pour le virus de la vaccine.
Les vecteurs AAV recombinants utilisés en recherche n’ont pas la protéine Rep et leur génome reste surtout épisomique ; leur expression peut être durable dans les cellules non divisantes, mais se dilue dans les cellules en division.
Les vecteurs viraux peuvent atteindre une efficacité de 90 à 100 % des cellules en culture, mais leur production nécessite un laboratoire spécialisé et leur utilisation expose à une toxicité et à des réactions immunitaires contre les protéines virales.
L’hydrodynamique transfecte surtout le foie ; les lentivirus et rétrovirus s’intègrent au génome
★ À maîtriser
📌 Les complexes cationiques injectés par voie intraveineuse peuvent s’accumuler dans les capillaires pulmonaires et provoquer une détresse respiratoire ou une mortalité si la dose ou la formulation est inadaptée, notamment en présence d’agrégats ou d’une charge excessive.
La Directive européenne 2010/63/UE est transposée en France dans le Code rural, notamment les articles R.214-87 et suivants, par le décret n° 2013-118 du 1er février 2013 et ses arrêtés d’application.
En France, un projet d’expérimentation animale doit être autorisé par l’autorité compétente après évaluation éthique par un comité ; le dossier est déposé dans l’application APAFIS.
📌 La règle des 3R applique le remplacement lorsque des modèles non animaux conviennent, la réduction par la planification et le partage des mesures, et le raffinement par des procédures et soins visant à limiter la souffrance.
📌 Les PNA remplacent le squelette phosphate par un squelette polyamide non chargé et résistent aux nucléases, mais leur pénétration cellulaire ou tissulaire reste problématique ; les phosphorothioates résistent aussi davantage aux nucléases et pénètrent mieux dans les cellules eucaryotes.
Compléments
📌 La production d’une lignée transgénique mobilise de nombreux animaux, ce qui justifie d’optimiser les rendements, de cryoconserver les lignées non utilisées et de planifier les croisements.
À partir du dernier tiers de la gestation, soit environ le 13ᵉ jour chez la souris, les fœtus de mammifères entrent dans le champ de la réglementation sur les animaux utilisés à des fins scientifiques.
Les niveaux de sévérité sont :
L’imagerie longitudinale du même animal à différents temps contribue à la réduction en évitant de sacrifier un animal pour chaque temps de mesure.
La reproductibilité est un enjeu éthique, car une expérience non reproductible a utilisé des animaux sans produire de résultat fiable.
Le gène CFTR, situé sur le chromosome 7, code une protéine transmembranaire qui régule le transport des ions chlorure.
Les mécanismes proposés pour l'action antisens sont : le blocage de l'épissage, le blocage du transport de l'ARN vers le cytoplasme, l'accélération de la dégradation de l'ARN, le blocage direct de la traduction
Chez E. coli, les ARN sok et hok s'hybrident et l'hybride formé est dégradé par la RNase III, illustrant la régulation par ARN antisens.
Une séquence antisens ciblée de 10 à 20 bases suffit généralement à obtenir un effet antisens spécifique.
★ À maîtriser
📌 Les siRNA sont le plus souvent exogènes, présentent une complémentarité totale avec une cible généralement unique et provoquent surtout le clivage de l'ARNm ; les miRNA sont endogènes, s'apparient partiellement à de nombreuses cibles et répriment surtout leur traduction.
Compléments
Le complexe RISC contient la protéine Argonaute et utilise un ARN guide pour reconnaître un ARNm cible par complémentarité de séquence.
Un siRNA fonctionnel possède un duplex de 19 nucléotides avec un débordement de 2 nucléotides à chaque extrémité 3'.
Dans un vecteur plasmidique, un shRNA peut être exprimé sous un promoteur U6 ou H1 puis maturé en siRNA par Dicer, ce qui permet un silencing stable.
Chez C. elegans, 16 757 des 19 757 gènes codant une protéine avaient été inactivés par RNAi dès 2004.
Pri-miRNA → pre-miRNA → duplex mature → RISC
★ À maîtriser
📌 L'antisens et l'ARN interférence agissent au niveau de l'ARN de façon transitoire, tandis que les nucléases programmables coupent directement l'ADN chromosomique et peuvent modifier durablement le génome.
📌 La NHEJ répare souvent une cassure double brin par des insertions ou délétions qui inactivent le gène, tandis que la recombinaison homologue utilise une matrice de réparation pour insérer une séquence ou corriger une mutation.
📌 La création ou l'utilisation d'un nouveau modèle animal génétiquement modifié nécessite une évaluation éthique et une autorisation de projet préalable dans le cadre de la directive européenne 2010/63/UE et de ses transpositions nationales.
Compléments
Les quatre grandes familles de nucléases programmables sont :
Chaque doigt de zinc reconnaît un triplet de bases, et un ZFN associe généralement 3 à 4 doigts de zinc au domaine nucléase FokI.
Dans les TALEN, les modules TALE comprennent 34 acides aminés et la base reconnue dépend des résidus variables 12 et 13 : NG reconnaît T, HD reconnaît C, NI reconnaît A et NN reconnaît G ou A.
Pour Cas9 de S. pyogenes, la séquence cible doit être immédiatement suivie d'un PAM 5'-NGG-3'.
📌 CRISPRi utilise dCas9 pour bloquer la transcription sans couper l'ADN, tandis que CRISPRa associe dCas9 à un domaine activateur pour stimuler l'expression génique.
En 2017, Mitalipov et al. ont rapporté la correction par CRISPR-Cas9 de la mutation MYBPC3 dans des embryons humains non destinés à l'implantation, avec un seul cas de mosaïcisme sur 58 embryons. - Nature
Le 7 janvier 2022, David Bennett, âgé de 57 ans, a reçu à l'université du Maryland un cœur de porc génétiquement modifié par CRISPR : 3 gènes porcins ont été supprimés, 1 gène a été inactivé et 6 gènes humains ont été ajoutés.
Les criblages par ARNi ou CRISPR peuvent contribuer au Remplacement en étant réalisés in vitro ou chez des organismes non couverts par la réglementation animale avant le recours aux rongeurs.
📌 La création directe de lignées par CRISPR peut réduire les générations d'accouplement et de sélection nécessaires, mais son faible coût a aussi favorisé la multiplication des lignées génétiquement modifiées.
NHEJ répare souvent en knockout ; HR avec matrice permet knock-in ou correction
| Méthode | Intervention | Résultat | Délai |
|---|---|---|---|
| Micro-injection d'ADN | Pronucléus du zygote | Souris transgénique | Environ 3 mois |
| Cellules ES | Recombinaison homologue ciblée | Souris knock-out | Environ 2 ans classiquement |
| CRISPR/Cas9 | Modification génétique ciblée | Modèle génétiquement modifié | Quelques mois |
| Croisement | Condition | Descendance |
|---|---|---|
| Homozygote × homozygote | Deux sexes homozygotes viables et fertiles | 100 % homozygotes |
| Hétérozygote × homozygote | Un génotype homozygote viable ou fertile | 50 % homozygotes, 50 % hétérozygotes |
| Hétérozygote × hétérozygote | Homozygotes mutants non viables ou non fertiles | 25 % mutants, 50 % hétérozygotes, 25 % sauvages |
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