Fiche de révision : Génétique moléculaire et séquençage

📋 Plan du Cours

1. Génétique mendélienne et moléculaire
2. Évolution du séquençage génomique
3. Méthode Sanger et séquençage parallèle
4. Assemblage et annotation du génome
5. RNA-seq et identification des gènes
6. Expression et fonction des gènes
7. Clonage positionnel des mutations

📖 1. Génétique mendélienne et moléculaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Lien séquence-fonction : Lien entre séquence d’ADN et fonction

📝 Points essentiels

📌 La génétique mendélienne étudie les caractères et leur transmission, tandis que la génétique moléculaire étudie les séquences d’ADN responsables de la mise en place des caractères.

💡 Astuce mémo

Mendélienne = transmission des caractères ; moléculaire = séquences ADN et fonctions.

📖 2. Évolution du séquençage génomique

★ À maîtriser

• Le séquençage initial du génome humain, achevé fin 2003, a duré 15 ans, utilisé la technologie Sanger et coûté 3 milliards de dollars.

• Le séquençage du génome de James Watson, réalisé en 2007, a duré 4 mois avec la technologie Roche 454 et coûté 1,5 millions de dollars.

• Le génome humain contient 3,2 10^9 paires de bases et 22 paires d’autosomes ainsi que les chromosomes sexuels X et Y.

Compléments

• Le séquençage d’un génome individuel est présenté comme réalisable en 1 jour pour un coût de 1000 dollars, avec une technologie qui évolue chaque jour.

💡 Astuce mémo

15 ans → 4 mois → 1 jour : la durée du séquençage diminue.

📖 3. Méthode Sanger et séquençage parallèle

📝 Points essentiels

• La méthode Sanger consiste à dénaturer l’ADN, hybrider une amorce complémentaire à une région connue, synthétiser des fragments avec une ADN polymérase et des dNTP et ddNTP fluorescents, puis séparer les fragments par électrophorèse sur gel et les détecter.

📌 Le séquençage PacBio détecte une émission de lumière pendant la synthèse d’un brin complémentaire, tandis que le séquençage Nanopore détecte une variation de courant lors du passage d’un brin dans un nanopore.

• Les techniques de séquençage massivement parallèle produisent un pool de molécules, séparent ces molécules, synthétisent un brin complémentaire, détectent un signal puis assemblent les séquences.

💡 Astuce mémo

Sanger détecte des fragments terminés ; PacBio détecte la lumière ; Nanopore détecte le courant.

📖 4. Assemblage et annotation du génome

🔑 Notions clés & Définitions

• Contig : Séquence complète reconstituée par assemblage de différents fragments de séquence obtenus

★ À maîtriser

• L’annotation informatique identifie les séquences codantes et non codantes à partir de la longueur des cadres de lecture, de la richesse en C et G des régions codantes et de la recherche d’homologies dans des bases de données comme Blast.

Compléments

• L’extraction de l’ADN fragmente les chromosomes et le séquençage ne produit pas de fragments dépassant 30 kB.

💡 Astuce mémo

Fragments → séquences brutes → assemblage → annotation.

📖 5. RNA-seq et identification des gènes

📝 Points essentiels

• 🔄 La synthèse d’ADNc suit quatre étapes:
  1. Fixation d’une amorce polyT sur l’ARN polyA
  2. Synthèse du premier brin d’ADNc par une transcriptase inverse
  3. Digestion ménagée du brin ARN par l’ARNase H
  4. Synthèse du second brin d’ADNc par une ADN polymérase

📌 Le RNA-seq permet de discriminer les régions transcrites des régions non transcrites et d’améliorer l’annotation du génome en identifiant les gènes exprimés dans un tissu.

💡 Astuce mémo

ARN polyA → ADN complémentaire → séquençage → comparaison avec le génome.

📖 6. Expression et fonction des gènes

📝 Points essentiels

• Le taux de transcription mesuré par RNA-seq permet de classer les gènes selon une expression forte, moyenne, faible ou absente ou très faible.

• La comparaison des transcriptomes de deux tissus ou de plusieurs conditions permet d’identifier des gènes spécifiques d’un tissu, impliqués dans son développement ou dans une réponse à des traitements et à des effets environnementaux.

💡 Astuce mémo

Variation d’expression entre tissus ou conditions → hypothèse sur la fonction du gène.

📖 7. Clonage positionnel des mutations

🔑 Notions clés & Définitions

• Clonage positionnel : Méthode qui caractérise la séquence d’un gène lorsque la seule information disponible est le phénotype obtenu après mutation du gène

★ À maîtriser

• 🔄 La création d’une collection de mutants suit ces étapes:

  1. Mutagénèse d’un individu F0
  2. Croisement avec un individu sauvage
  3. Production de familles F2
  4. Criblage des descendants selon le phénotype d’intérêt

• La cartographie d’une mutation repose sur la coségrégation du phénotype avec les formes alléliques de marqueurs moléculaires répartis dans le génome.

• Dans l’exemple de cartographie, les distances entre la mutation et les marqueurs A, B, C, D, E, F et G sont respectivement de 48 cM, 50 cM, 52 cM, 15 cM, 35 cM, 49 cM et 51 cM, ce qui positionne la mutation près du marqueur D.

• 🔄 La stratégie de clonage positionnel comprend:

  1. Obtenir une population de descendants entre un individu sauvage et un mutant
  2. Calculer les distances mutation-marqueur pour obtenir une localisation grossière
  3. Augmenter la précision avec davantage d’individus et de marqueurs
  4. Analyser les cadres de lecture de la région caractérisée
  5. Complémenter éventuellement le mutant avec la séquence sauvage

Compléments

• La précision de la position cartographique augmente avec le nombre d’individus et le nombre de marqueurs, ce qui réduit l’intervalle dans lequel se trouve la mutation.

💡 Astuce mémo

Mutagénèse → criblage → cartographie → précision → identification et complémentation.

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des techniques de séquençage