Fiche de révision : Méthodes d’étude des cellules et tissus

📋 Plan du Cours

1. Culture cellulaire et lignées
2. Anticorps et immunodétection
3. Séparation et détection des protéines
4. Fractionnement des organites
5. Cytométrie en flux
6. Manipulations génétiques KI et KO
7. Extinction génétique contrôlée
8. CRISPR et analyse expérimentale

📖 1. Culture cellulaire et lignées

🔑 Notions clés & Définitions

• Culture cellulaire : Permet de faire croître des cellules hors de leur organisme ou de leur milieu d’origine, dans des conditions contrôlées.

★ À maîtriser

• 🔄 La mise en culture comprend les étapes suivantes:
  1. Isolement des cellules par dissociation mécanique ou chimique
  2. Placement dans un milieu adapté contenant éventuellement des facteurs de croissance et un support
  3. Prolifération des cellules si elles en sont capables

📌 Une culture primaire provient d’un organisme pluricellulaire et reste très sensible à son environnement, tandis qu’une lignée cellulaire peut être maintenue indéfiniment en culture.

Compléments

📌 Les cellules circulantes sont cultivées en suspension, tandis que les cellules organisées en tissu sont généralement adhérentes à un support.

• Les lignées cellulaires peuvent modifier leur phénotype sous l’effet des conditions de culture ou de l’accumulation d’anomalies génétiques et chromosomiques, ce qui peut réduire la reproductibilité entre laboratoires.

💡 Astuce mémo

Culture primaire limitée, lignée immortelle

📖 2. Anticorps et immunodétection

🔑 Notions clés & Définitions

• Anticorps : Glycoprotéine soluble de type immunoglobuline qui se fixe spécifiquement à un antigène donné.

📝 Points essentiels

📌 L’épitope est la partie de l’antigène reconnue par l’anticorps, tandis que le paratope est la partie de l’anticorps qui interagit avec l’épitope.

📌 Un anticorps monoclonal provient d’un même clone de plasmocytes et reconnaît un même épitope, tandis qu’un anticorps polyclonal provient de plusieurs clones et peut reconnaître plusieurs épitopes.

• L’immunomarquage localise une protéine dans une coupe de tissu en préparant la coupe, en ajoutant un anticorps marqué dirigé contre la protéine, puis en visualisant le marqueur au microscope.

📌 L’immunohistochimie utilise un anticorps couplé à une enzyme qui transforme un substrat incolore en produit coloré insoluble, tandis que l’immunofluorescence utilise un anticorps couplé à un fluorochrome observé au microscope à fluorescence.

💡 Astuce mémo

Monoclonal = un épitope ; polyclonal = plusieurs épitopes

📖 3. Séparation et détection des protéines

🔑 Notions clés & Définitions

• SDS-PAGE : Sépare les protéines selon leur poids moléculaire apparent et permet de l’estimer grâce à des marqueurs de poids moléculaire connus.
• Western blot : Détecte une protéine d’intérêt grâce à un anticorps spécifique et permet d’estimer sa masse moléculaire après séparation par SDS-PAGE.
• Immunoprécipitation : Détecte les partenaires d’une protéine en précipitant avec elle les protéines associées, qui peuvent ensuite être identifiées par Western blot.

★ À maîtriser

• Lors de la SDS-PAGE, les protéines sont dénaturées par chauffage, SDS et β-mercaptoéthanol, migrent vers l’anode dans un gel, puis sont révélées sous forme de bandes, par exemple au bleu de Coomassie.

Compléments

• 🔄 Le Western blot comprend les étapes suivantes:
  1. Séparation par SDS-PAGE
  2. Transfert vers une membrane de nitrocellulose
  3. Immunodétection et révélation

💡 Astuce mémo

SDS-PAGE sépare, transfert, Western révèle

📖 4. Fractionnement des organites

🔑 Notions clés & Définitions

• Fractionnement cellulaire : Sépare les organites afin de pouvoir les étudier séparément, en exploitant leurs différences de densité et de coefficients de sédimentation.
• Gradient de densité : Sépare plus efficacement les organites en les faisant migrer jusqu’à une zone dont la densité est identique à la leur.

📝 Points essentiels

• 🔄 Le fractionnement cellulaire comprend les étapes suivantes:

  1. Lyse du tissu et des cellules
  2. Centrifugation
  3. Recueil des culots
  4. Analyse des fractions

• L’ordre de sédimentation est:

  • Noyaux
  • Mitochondries et lysosomes
  • Fragments de membrane plasmique et microsomes
  • Ribosomes

💡 Astuce mémo

Lyse → centrifugation → culots → analyse

📖 5. Cytométrie en flux

🔑 Notions clés & Définitions

• Cytométrie en flux : Analyse automatiquement des cellules individuelles qui passent une à une devant un laser dans un flux liquide, et permet notamment de les classer ou de les trier.

★ À maîtriser

📌 La diffusion axiale FSC renseigne notamment sur la taille cellulaire, tandis que la diffusion latérale SSC renseigne notamment sur la granularité ou la structure cellulaire.

📌 Dans l’analyse du cycle cellulaire par la quantité d’ADN, G1 contient un ADN non dupliqué, S correspond à la réplication de l’ADN et G2/M contient un ADN dupliqué.

Compléments

• La cytométrie en flux comprend:
  • Réseau fluidique
  • Banc optique avec laser, filtres et détecteurs
  • Microprocesseur

💡 Astuce mémo

FSC = taille ; SSC = granularité

📖 6. Manipulations génétiques KI et KO

★ À maîtriser

📌 Le knock-in ajoute ou introduit un gène, tandis que le knock-out inhibe, invalide ou éteint un gène.

• Les principaux types de KO sont:
  • KO total : invalidation définitive dans tout l’organisme
  • KO conditionnel : invalidation à un moment choisi
  • KO spécifique : invalidation dans certains tissus ou types cellulaires

Compléments

• La GFP, ou Green Fluorescent Protein, rend une protéine repérable lorsqu’elle est fusionnée avec elle dans une stratégie de knock-in.

📌 Un KO total peut être impossible lorsque le gène est indispensable à la vie, car son invalidation peut entraîner la mort ou bloquer le développement.

💡 Astuce mémo

KI ajoute, KO enlève

📖 7. Extinction génétique contrôlée

★ À maîtriser

• Le siRNA bloque l’expression d’un gène en s’associant à un ARNm complémentaire, ce qui entraîne la dégradation de cet ARNm et une très forte diminution de l’expression du gène.

• Dans la stratégie Cre-Lox, la recombinase Cre reconnaît deux séquences loxP entourant un gène et provoque l’excision de ce gène dans les cellules où Cre est active.

📌 Un promoteur spécifique d’un tissu peut contrôler l’expression de Cre et permettre un KO limité à ce tissu.

Compléments

📌 L’extinction par siRNA n’est pas totale et il est difficile de cibler précisément un type cellulaire.

💡 Astuce mémo

siRNA dégrade l’ARNm → l’expression diminue

📖 8. CRISPR et analyse expérimentale

🔑 Notions clés & Définitions

• CRISPR-Cas9 : Système permettant de réaliser une coupure spécifique de l’ADN afin de modifier le génome ou d’invalider un gène.

★ À maîtriser

• CRISPR-Cas9 fonctionne grâce à un ARN guide complémentaire de la cible, qui s’associe à Cas9, reconnaît l’ADN cible avec une séquence PAM, puis provoque une coupure double brin.

📌 Deux ARN guides peuvent éliminer une séquence d’ADN, une dCas9 non fonctionnelle peut réprimer un gène sans couper l’ADN, et une dCas9 fusionnée à un activateur peut augmenter l’expression d’un gène.

Compléments

📌 Les coupures off target correspondent à des coupures de l’ADN réalisées par Cas9 en dehors de la région ciblée.

📌 Les barres d’erreur représentent une valeur accompagnée d’une incertitude, qui peut correspondre à l’écart-type ou à l’écart-type de la moyenne, tandis que les étoiles indiquent le niveau de significativité d’une différence entre groupes.

💡 Astuce mémo

ARN guide → Cas9 → ADN ciblé → coupure

📊 Tableaux de synthèse

Méthodes et objectif principal

Manipulations génétiques