Fiche de révision : Milieux de culture animale in vitro

📋 Plan du Cours

1. Rôles des milieux de culture
2. Composition du milieu minimal
3. Rôle et limites du sérum
4. Exemple du milieu DMEM
5. Contaminations et prévention
6. Conditions physico-chimiques de culture

📖 1. Rôles des milieux de culture

🔑 Notions clés & Définitions

• Milieu de culture animale in vitro : Assure la nutrition et le support des cellules, contribue au maintien du pH et de l’osmolarité, et doit être stérile.

📝 Points essentiels

• Les milieux de culture animale sont généralement constitués d’une base minimale complétée par un additif complexe, le sérum.

💡 Astuce mémo

NSS : nutrition, support, stabilité physico-chimique

📖 2. Composition du milieu minimal

🔑 Notions clés & Définitions

• Base minimale : Milieu synthétique de composition parfaitement maîtrisée contenant les éléments indispensables à la culture cellulaire, comme MEM, DMEM, RPMI et HAM.

★ À maîtriser

• Les minéraux indispensables sont:

  • le sodium
  • le potassium
  • le calcium
  • le magnésium
  • le phosphate
  • le carbonate
  • le chlore

• Le D-glucose est le substrat énergétique généralement utilisé à une concentration de 1 g.L-1, correspondant à la concentration physiologique du sang humain.

• La base minimale contient 12 acides aminés indispensables en plus de la L-glutamine, qui est très instable à 37 °C et doit être ajoutée extemporanément.

Compléments

• Les minéraux participent au maintien de la pression osmotique, aux transports membranaires, au métabolisme, aux réactions enzymatiques et, grâce au calcium et au magnésium, à l’attachement et à l’étalement des cellules.

• Les vitamines indispensables sont:

  • la choline
  • l’acide folique
  • le pyridoxal
  • la riboflavine
  • la thiamine
  • l’inositol
  • l’acide nicotinique
  • l’acide pantothénique

📖 3. Rôle et limites du sérum

🔑 Notions clés & Définitions

• Sérum : Additif complexe, incomplètement défini, indispensable à la plupart des cellules et généralement utilisé à raison de 5 à 20 % (V/V) selon le type cellulaire.

★ À maîtriser

• Le sérum apporte des facteurs de croissance, des oligoéléments, des vitamines et des hormones, dont l’action synergique stimule globalement la croissance cellulaire.

• Le sérum favorise l’adhérence et l’étalement des cellules grâce à des facteurs d’ancrage comme la fibronectine, stimule leur prolifération et inhibe la trypsine.

Compléments

📌 Les sérums animaux peuvent être contaminés par des virus ou des mycoplasmes, et leurs concentrations variables en hormones et facteurs de croissance rendent le pouvoir prolifératif dépendant des lots.

📌 Un milieu totalement défini est un milieu synthétique sans sérum dont la composition est rigoureusement connue, mais son usage reste limité à très peu de lignées cellulaires.

💡 Astuce mémo

Sérum stimulant mais variable, milieu défini maîtrisé mais limité

📖 4. Exemple du milieu DMEM

🔑 Notions clés & Définitions

• Milieu DMEM : Exemple de milieu de culture contenant notamment des acides aminés, des vitamines, du glucose, des sels minéraux et du rouge de phénol.

★ À maîtriser

• Le DMEM est complété extemporanément par 10 % de sérum de veau fœtal, apportant des protéines, des acides gras, des facteurs d’adhésion, des facteurs de croissance et des inhibiteurs.

Compléments

• Le DMEM peut recevoir de la pénicilline à 100 U.mL-1 et de la streptomycine à 100 μg.mL-1.

• Le DMEM peut recevoir de la Fungizone à 2,5 μg.mL-1.

📖 5. Contaminations et prévention

★ À maîtriser

• Les contaminations peuvent provenir:

  • du sérum
  • du milieu
  • des réactifs
  • des cellules
  • de l’air
  • de l’eau
  • des mains du technicien
  • du matériel de culture

• La contamination par les mycoplasmes est particulièrement problématique, car ces bactéries sans paroi mesurent 0,1 à 0,3 μm et peuvent modifier la croissance, la viabilité, les chromosomes et l’expression phénotypique des cellules.

📌 Les mycoplasmes déshydratés restent viables pendant 7 à 10 jours et peuvent contaminer la verrerie, les mains et la surface de travail malgré de bonnes conditions d’asepsie.

• La prévention des contaminations repose sur le test et le traitement des cellules reçues, la désinfection des surfaces après chaque culture, le nettoyage régulier de la pièce et l’absence de mouchage ou de toux devant la hotte.

Compléments

• Les mycoplasmes peuvent être détectés par DAPI, par fluorochrome de Hoechst ou par PCR, tandis que le traitement dépend de la lignée cellulaire et présente une efficacité variable.

💡 Astuce mémo

Contamination → perturbation de la croissance, de la viabilité et du phénotype

📖 6. Conditions physico-chimiques de culture

★ À maîtriser

• La température de culture est maintenue à 37 °C dans une étuve.

• Le pH du milieu doit être compris entre 7,2 et 7,4 et ses variations sont contrôlées par le rouge de phénol, jaune en milieu acide et rouge en milieu basique.

📐 Formule — Le système tampon minéral repose sur l’équilibre $CO_2 + H_2O \rightleftharpoons H_2CO_3 \rightleftharpoons HCO_3^- + H_3O^+$ et $HCO_3^- \rightleftharpoons CO_2 + OH^-$.

• Le système tampon minéral est en équilibre avec une atmosphère contenant 5 % de CO2 afin de limiter l’acidification ou l’alcalinisation du milieu.

Compléments

• L’environnement gazeux contient:

  • de l’azote
  • de l’oxygène à une pression partielle de 21 %
  • du CO2 à une pression partielle de 5 %
  • de la vapeur d’eau

• L’humidité de l’air est maintenue entre 84 et 85 % afin de prévenir l’évaporation et l’augmentation de l’osmolarité du milieu.

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des milieux avec ou sans sérum