Fiche de révision : Outils de biologie moléculaire

📋 Plan du Cours

1. Extraction et évaluation des acides nucléiques
2. Électrophorèse des acides nucléiques
3. Enzymes de restriction et nucléases
4. Polymérases et ligases
5. PCR conventionnelle et cinétique
6. Variantes et limites de la PCR

📖 1. Extraction et évaluation des acides nucléiques

★ À maîtriser

• 🔄 L’extraction des acides nucléiques comprend quatre étapes:

  1. Lyse tissulaire et/ou cellulaire
  2. Dénaturation ou dissociation des protéines
  3. Inactivation des nucléases
  4. Purification ou isolement des acides nucléiques

• À la fin d’une extraction, les acides nucléiques sont pures à environ 60 %, car une extraction n’est pas une purification complète.

• Pour un tissu dense, la lyse mécanique se fait par broyage, puis la lyse cellulaire utilise le plus souvent un détergent comme le SDS et/ou une enzyme comme la protéinase K.

📌 Les acides nucléiques absorbent à 260 nm grâce à leurs bases hétérocycliques, tandis que les protéines absorbent à 280 nm grâce à leurs acides aminés aromatiques.

Compléments

• Les acides nucléiques chargés négativement peuvent être isolés par chromatographie échangeuse d’ions avec une résine chargée négativement, ou par chromatographie d’adsorption.

• L’hyperchromie correspond au fait qu’une molécule d’ADN double brin absorbe moins qu’une molécule d’ADN simple brin.

• Au laboratoire, les ADN sont congelés à -20 °C.

💡 Astuce mémo

Lyse → dénaturation/inactivation → purification → évaluation

📖 2. Électrophorèse des acides nucléiques

📝 Points essentiels

• Le gel d’agarose est le support le plus utilisé pour l’électrophorèse des acides nucléiques.

📌 L’électrophorèse sépare les acides nucléiques selon leur taille, exprimée en paires de bases pour les doubles brins et en nucléotides pour les simples brins.

💡 Astuce mémo

Agarose pour séparer selon la taille ; polyacrylamide pour faire migrer les brins d’ADN

📖 3. Enzymes de restriction et nucléases

🔑 Notions clés & Définitions

• Enzymes de restriction : Nucléases qui reconnaissent un motif et coupent l’ADN double brin de manière définie et reproductible en rompant des liaisons phosphodiester.

★ À maîtriser

• Un isoschizomère provient d’une origine différente mais reconnaît le même site et coupe de la même manière, tandis qu’un néoschizomère reconnaît le même site mais coupe différemment.

• Les enzymes de restriction produisent soit des extrémités franches, soit des extrémités cohésives ou protrusives avec une extrémité 3’ ou 5’ sortante.

• Des enzymes de restriction sont compatibles lorsque leurs coupures libèrent des extrémités pouvant être ligaturées ; toutes les enzymes produisant des bouts francs sont compatibles entre elles, mais ce n’est pas le cas de toutes celles produisant des bouts sortants.

• La RNAse A dégrade l’ARN simple brin ou double brin et est utilisée lors de l’extraction d’ADN, tandis que la RNAse H dégrade uniquement l’ARN associé à l’ADN dans un hybride ADN/ARN.

Compléments

• La plupart des enzymes de restriction utilisées au laboratoire sont des enzymes de type II.

• Une unité d’activité d’enzyme de restriction est la quantité nécessaire pour couper 1 microgramme d’ADN de phage lambda à 37 °C pendant 1 heure.

📌 La DNAse I est une endonucléase qui coupe après un nucléotide à pyrimidine, T ou C, et peut éliminer les traces d’ADN lors de l’extraction d’ARN.

💡 Astuce mémo

Endonucléase : coupe au sein de l’ADN ; exonucléase : agit depuis une extrémité

📖 4. Polymérases et ligases

🔑 Notions clés & Définitions

• Taq polymérase : Issue de Thermus aquaticus, synthétise de l’ADN en recopiant une matrice d’ADN et possède une activité de polymérisation 5’→3’ ainsi qu’une activité exonucléasique 3’→5’.
• Transcriptase inverse : ADN polymérase qui synthétise un ADN complémentaire en recopiant une matrice d’ARN.
• Ligase : Relie deux molécules d’ADN existantes en formant une liaison phosphodiester entre une extrémité 3’OH et une extrémité 5’P.

★ À maîtriser

📌 Une ADN polymérase ne peut pas commencer seule une synthèse d’ADN et ne fait qu’allonger un brin préexistant.

Compléments

• La T4 DNA ligase est la ligase la plus utilisée au laboratoire.

💡 Astuce mémo

La polymérase allonge ; la ligase relie une extrémité 3’OH à une extrémité 5’P

📖 5. PCR conventionnelle et cinétique

🔑 Notions clés & Définitions

• PCR : Réaction enzymatique de polymérisation en chaîne qui amplifie un fragment spécifique d’ADN.

★ À maîtriser

• Le milieu de PCR contient: une matrice d’ADN, deux amorces, une Taq polymérase, des dNTP, un tampon contenant notamment des sels de Mg2+

• 🔄 Chaque cycle de PCR comprend:

  1. Dénaturation à 94 °C pendant 30 secondes
  2. Hybridation des amorces vers 50–60 °C
  3. Polymérisation à 72 °C par la Taq polymérase

• Les amorces de PCR sont des oligonucléotides simple brin d’environ 20 nucléotides, et une séquence de 20 nucléotides ne se rencontre statistiquement qu’une fois dans un génome.

📌 La PCR nécessite de connaître la séquence du brin d’ADN ciblé afin de choisir les séquences des amorces, dont la température de fusion dépend de la taille, de la séquence et de la quantité de sel du milieu.

📌 La phase de latence correspond aux cycles nécessaires pour faire apparaître les fragments de taille attendue, la phase exponentielle à leur amplification préférentielle, et la phase plateau à l’appauvrissement des amorces et à la diminution de l’activité de la Taq polymérase.

📐 Formule — Avec un rendement de PCR de 100 %, la quantité obtenue après n cycles vérifie $Q_n = A_0 \times 2^n$.

Compléments

• Une PCR répète généralement 30 cycles de dénaturation, d’hybridation et de polymérisation dans un thermocycleur, et dure environ 1 heure 30.

💡 Astuce mémo

Dénaturation → hybridation → polymérisation

📖 6. Variantes et limites de la PCR

🔑 Notions clés & Définitions

• PCR multiplex : Utilise un seul milieu réactionnel pour amplifier simultanément plusieurs fragments.
• PCR quantitative : Ou PCR en temps réel, quantifie une cible dans l’échantillon initial en reliant le nombre de cycles nécessaires pour entrer en phase exponentielle à la quantité initiale de cible.
• PCR digitale : Repose sur un partitionnement de l’échantillon en 10 000 à 20 000 compartiments contenant chacun zéro ou une molécule cible.

★ À maîtriser

📌 La PCR peut amplifier une très faible quantité d’ADN, mais une contamination par une seule molécule peut être amplifiée et produire un faux positif.

• Pour limiter les contaminations, le laboratoire sépare la pré-PCR, la pièce PCR et la post-PCR, avec une marche en avant sans retour en arrière.

📌 La détection non spécifique de la PCR quantitative utilise une molécule intercalante fluorescente, mais ne permet pas de réaliser une PCR multiplex, tandis que la détection spécifique utilise une sonde complémentaire de la cible.

Compléments

• Le sang peut contenir des inhibiteurs enzymatiques susceptibles de gêner la PCR.

• Les sondes TaqMan sont des sondes d’ADN simple brin de 30 à 50 nucléotides marquées par un reporter et un quencher, et la fluorescence du reporter est proportionnelle à la quantité de produit PCR généré.

💡 Astuce mémo

PCR multiplex : plusieurs fragments ; PCR quantitative : mesure d’une cible

📊 Tableaux de synthèse

Principales enzymes et matrices