Fiche de révision : Principes fondamentaux de la chromatographie liquide

📋 Plan du Cours

1. Chaîne instrumentale et modules de la chromatographie liquide haute performance (HPLC)
2. Fonctionnement et types d'injecteurs en HPLC
3. Colonnes et phases stationnaires en chromatographie liquide
4. Force éluante, indice ε0 et sélectivité des solvants en phase liquide
5. Classification des méthodes en chromatographie en phase liquide et phases mobiles en phase normale
6. Influence des facteurs liés à la phase stationnaire et à la phase mobile sur la rétention en chromatographie liquide
7. Phases stationnaires en chromatographie en phase inverse et modes d'interaction
8. Influence du pH, appariement d’ions et facteurs affectant la rétention en phase inverse

📖 1. Chaîne instrumentale et modules de la chromatographie liquide haute performance (HPLC)

🔑 Notions clés & Définitions

• Module pompe : Composant assurant la circulation continue de la phase mobile à travers l'injecteur, la colonne et le détecteur, avec une force suffisante pour faire passer la phase mobile à travers une colonne à petit diamètre.
• Module injecteur : Dispositif permettant d'introduire l'échantillon dans la colonne sans interrompre le débit continu de la phase mobile.

📝 Points essentiels

• La chaîne HPLC est constituée d'une séquence de modules intercalés : pompe, injecteur, colonne thermostatée, détecteur, et éventuellement collecteur de fractions.
• Le détecteur doit être adapté à la détection des composés séparés et peut être couplé à un collecteur de fractions pour récupérer les molécules séparées.
• On va d’abord retrouver la pompe qui va permettre de pomper la phase liquide et de l'envoyer dans le système de chromatographie (pousse la phase mobile à travers l’injecteur, la colonne et le détecteur).
• De plus, on va avoir différentes qualités requises pour une pompe: - elle doit être puissante => elle doit avoir une force assez importante pour faire passer la phase mobile à travers une colonne ayant un tout petit diamètre de particules.

💡 À retenir

Comprendre la composition modulaire de la chaîne HPLC est essentiel pour maîtriser le fonctionnement global et l'intégration des étapes de séparation et détection.

📖 2. Fonctionnement et types d'injecteurs en HPLC

🔑 Notions clés & Définitions

• Injecteur automatique : Type d'injecteur qui prélève l'échantillon dans des vials fermés par un septum, permettant la préservation et la thermostatisation des échantillons ainsi que la programmation automatique des injections.
• Phase mobile : Vient de la pompe dans les 2 positions.
• Manière très précise : Avoir un débit précis
• Coûte très : Cette machine est très intéressante mais coûte très chère.

📝 Points essentiels

• L'injecteur doit permettre l'injection précise de faibles volumes avec un coefficient de variation inférieur à 1%.
• L'injection se fait généralement en ligne, sans interrompre le débit de la phase mobile.
• L'injecteur manuel utilise une vanne Rhéodyne avec deux positions : 'load' pour charger la boucle et 'inject' pour introduire l'échantillon dans la colonne.

💡 À retenir

Maîtriser les différents types d'injecteurs et leur fonctionnement garantit une injection précise et reproductible, clé de la qualité analytique en HPLC.

📖 3. Colonnes et phases stationnaires en chromatographie liquide

🔑 Notions clés & Définitions

• Phases stationnaires : Sont contenues dans ces colonnes en HPLC sont des phases stationnaires présentent sous forme de particules de très petites tailles (entre 1 et 5 μm).

📝 Points essentiels

• La surface spécifique (Sp) de la phase stationnaire correspond au nombre de sites d'interaction disponibles pour la rétention des solutés.
• La désactivation de la silice par hydratation diminue β* et réduit la rétention, améliorant la reproductibilité des séparations.

💡 À retenir

La nature et l’état de la phase stationnaire dans la colonne déterminent la capacité de séparation et la reproductibilité en chromatographie liquide.

📖 4. Force éluante, indice ε0 et sélectivité des solvants en phase liquide

🔑 Notions clés & Définitions

• Sélectivité des solvants : Propriété des solvants qui reflète leur aptitude à différencier les solutés selon trois types d'interactions principales : caractère dipôle-dipôle (π*), caractère accepteur de protons (β), et caractère donneur de protons (α).

📝 Points essentiels

• La force éluante d’un solvant dépend de la phase stationnaire, étant plus élevée pour les solvants faibles en ε0 en phase inverse.
• La sélectivité des solvants est basée sur trois interactions : dipôle-dipôle, acceptation et don de protons, classés dans le triangle de Snyder.
• Les solvants polaires ont un ε0 élevé, tandis que les solvants faibles en ε0 sont plus forts en phase inverse.
• 10 Tableau à titre d’information qui correspond à la transposition directe du triangle On peut retrouver dans ce tableau beaucoup de solvants rangés du plus polaires au plus apolaires ainsi que quelques paramètres sur ces solvants comme: - le force éluante (Strength) - leur viscosité - leur indice de réfraction - leur longueur d’onde jusqu’à laquelle il absorbe (UV cutoff) - leur point d'ébullition - leur caractère acide - leur caractère basique - leur caractère dipôle Il faut toujours faire attention à tous ces paramètres lorsque que l’on étudie une molécule.
• Autrement dit, les solvants forts sont des solvants ayant la force éluante la plus élevée.

💡 À retenir

L’indice ε0 et la sélectivité des solvants sont essentiels pour choisir la phase mobile adaptée aux interactions soluté-phase stationnaire.

📖 5. Classification des méthodes en chromatographie en phase liquide et phases mobiles en phase normale

🔑 Notions clés & Définitions

• Réponse : En effet, cela va permettre de commencer avec les phases mobiles de force éluantes faibles et de les augmenter au cours du temps.
• Chromatographie en phase normale : Méthode chromatographique utilisant une phase stationnaire polaire et une phase mobile généralement constituée d'un mélange binaire de solvants organiques apolaires et polaires.

📝 Points essentiels

• La chromatographie en phase liquide se divise en quatre grands types selon la nature de la phase stationnaire : phase normale, phase inverse, chromatographie ionique et chromatographie d'exclusion stérique.
• En chromatographie en phase normale, la phase stationnaire est polaire et la phase mobile est souvent un mélange binaire composé d'un solvant organique apolaire et d'un solvant polaire.
• La force éluante en phase normale est caractérisée par ε0, qui augmente avec la polarité du solvant, ce qui accroît la capacité d'élution des composés.
• La sélectivité de la phase mobile peut être adaptée en choisissant des solvants favorisant des interactions spécifiques, telles que les interactions dipôle-dipôle, pour optimiser la séparation.
• On peut également retrouver les interactions dipole-dipole, les interactions pi-pi et les liaisons hydrogènes.

💡 À retenir

La classification des méthodes en chromatographie en phase liquide et la composition des phases mobiles en phase normale permettent d'adapter la séparation aux propriétés des solutés et aux interactions recherchées.

📖 6. Influence des facteurs liés à la phase stationnaire et à la phase mobile sur la rétention en chromatographie liquide

🔑 Notions clés & Définitions

• Solvants isoactivants : Des solvants capables de maintenir un pourcentage constant d'eau à la surface de la silice, assurant ainsi une meilleure reproductibilité des séparations en chromatographie liquide.
• Énergie d'adsorption (E0) : La quantité d'énergie liée à l'interaction entre un soluté et la surface de la silice, dépendant du nombre de groupements interagissant et de leur polarité, influençant l'ordre d'élution des solutés.
• Rétention des solutés : Plus la surface spécifique est élevée, plus la capacité de rétention des solutés (k) est élevée.

📝 Points essentiels

• La surface spécifique de la phase stationnaire détermine le nombre de sites d'interaction et influence la capacité de rétention des solutés.
• L'activité de la silice (β*) dépend du taux d'hydratation : une silice desséchée augmente la rétention, une silice hydratée la diminue.
• L’énergie d’adsorption dépend de : - du nombre de groupements interagissant avec la silice.
• L’énergie de l'interaction augmente quand la polarité des molécules augmente.

💡 À retenir

La surface spécifique de la phase stationnaire détermine le nombre de sites d'interaction et influence la capacité de rétention des solutés.

📖 7. Phases stationnaires en chromatographie en phase inverse et modes d'interaction

🔑 Notions clés & Définitions

• Surface hydrocarbonée : Grandeur caractérisant l'hydrophobicité de la phase stationnaire en phase inverse, elle résulte du produit du nombre et de la longueur des greffons alkyle présents sur la silice.
• Chromatographie en phase inverse : Technique chromatographique utilisant une phase stationnaire apolaire greffée sur silice, où la rétention des composés hydrophobes augmente avec la longueur et la densité des chaînes alkyles.
• Interactions hydrophobes : Ces deux mécanismes utilisent des interactions électrostatiques qui s'ajoutent au reste des interactions hydrophobes classiquement observées en phase inverse.

📝 Points essentiels

• La surface hydrocarbonée, produite par le nombre et la longueur des greffons alkyle, détermine l'hydrophobicité de la phase stationnaire et influence la rétention.
• Plus les chaînes alkyles sont longues et nombreuses, meilleure est la rétention des composés hydrophobes.
• Les interactions hydrophobes sont majoritaires, mais d'autres interactions comme celles avec silanols résiduels peuvent aussi affecter la séparation.
• On a dit que les interactions majoritaires avec la phase stationnaire étaient des interactions hydrophobes, en réalité en fonction de la nature de la phase stationnaire on va pouvoir observer plus ou moins d’autres types d'interactions.

💡 À retenir

La surface hydrocarbonée, produite par le nombre et la longueur des greffons alkyle, détermine l'hydrophobicité de la phase stationnaire et influence la rétention.

📖 8. Influence du pH, appariement d’ions et facteurs affectant la rétention en phase inverse

🔑 Notions clés & Définitions

• Facteur de rétention (k) : Alcanes qui sera inférieur à celui des alcènes… comme on peut voir sur l’image suivante.
• Chromatographie d’appariement d’ions : Processus où un ion chargé forme une paire avec un contre-ion chargé de charge opposée, modifiant la rétention des composés ionisables.

📝 Points essentiels

• Le pH de la phase mobile contrôle l'ionisation des solutés, modifiant leur facteur de rétention en phase inverse.
• La chromatographie d’appariement d’ions utilise un réactif contre-ion hydrophobe chargé pour augmenter la rétention des solutés ionisés.
• Les paires d’ions modifient les mécanismes classiques de rétention en phase inverse par échanges d’ions et interactions électrostatiques.

💡 À retenir

La modulation du pH et l’utilisation d’appariement d’ions permettent de contrôler la rétention et la séparation des composés ionisables en phase inverse.

📊 Tableaux de Synthèse

Comparaison des modules en HPLC

Influence des facteurs sur la rétention

⚠️ Pièges & Confusions Fréquentes

1. Confusion entre force éluante et indice ε0, qui ne sont pas la même chose.
2. Mélanger les types d'interactions en phase inverse, notamment hydrophobes et résiduels silanols.
3. Sous-estimer l'importance du pH dans la modulation de la rétention.
4. Confondre injecteur manuel et automatique en termes de précision.
5. Oublier l'impact de la longueur des chaînes alkyles sur l'hydrophobicité.
6. Ne pas considérer l'effet de l'hydratation de la silice sur la rétention.
7. Confondre la classification des solvants selon leur ε0 et leur force éluante.

✅ Checklist Examen

1. Vérifier la composition modulaire de la chaîne HPLC.
2. Maîtriser le fonctionnement des injecteurs.
3. Comprendre la nature des phases stationnaires.
4. Savoir choisir le solvant selon sa sélectivité.
5. Évaluer l'effet du pH sur la rétention.
6. Identifier les modes d'interaction en phase inverse.
7. Analyser l'influence de la surface spécifique.
8. Connaître les facteurs d'appariement d'ions.