Fiche de révision : Structures des acides nucléiques

📋 Plan du Cours

1. Composition des acides nucléiques
2. Bases azotées et nucléotides
3. Liaisons et nomenclature nucléotidiques
4. Polymérisation et polarité des chaînes
5. Structure et propriétés de l’ADN
6. Variations et accessibilité de l’ADN
7. Dénaturation et renaturation de l’ADN
8. Structure et appariement des ARN
9. Principaux types d’ARN
10. Structures des ARN spécialisés
11. Maturation et action des micro-ARN
12. Extraction et hydrolyse des acides nucléiques
13. Hybridation, polymérases et PCR
14. PCR-RFLP et drépanocytose
15. Quantification des ARN et PCR digitale
16. Séquençage Sanger et nomenclature
17. Séquençage de nouvelle génération

📖 1. Composition des acides nucléiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Acide nucléique : Polynucléotide, c’est-à-dire un polymère de nucléotides qui maintient l’information génétique.

★ À maîtriser

📌 L’ADN constitue la copie source des informations cellulaires, principalement stockées dans le noyau, tandis que l’ARN assure le passage de ces informations vers le cytoplasme et leur mise en fonction.

• L’ordre des bases constitue la partie informative des acides nucléiques et forme un alphabet génétique de quatre lettres.

Compléments

• La partie monotone des acides nucléiques est constituée par la répétition d’enchaînements sucre-phosphate, qui servent de support sans porter l’information génétique.

📖 2. Bases azotées et nucléotides

🔑 Notions clés & Définitions

• Nucléotide : Constitué d’une base azotée, d’un sucre et d’un ou plusieurs groupements phosphate.
• Nucléoside : L’association d’une base azotée et d’un sucre.
• Base azotée : Un hétérocycle aromatique contenant au moins un atome d’azote en plus du carbone.

★ À maîtriser

📌 Les bases puriques, adénine et guanine, possèdent deux hétérocycles accolés et se lient au sucre par l’azote 9, tandis que les bases pyrimidiques, cytosine, thymine et uracile, possèdent un cycle et se lient par l’azote 1.

Compléments

• L’adénine est une 6-aminopurine portant une fonction amine NH₂ sur le carbone 6.

• La guanine est une 2-amino-6-oxopurine portant une fonction amine sur le carbone 2 et une fonction carbonyle en C6.

• La cytosine est une 2-oxo-4-aminopyrimidine portant une fonction amine en C4 et une cétone en C2.

• L’uracile est une 2,4-dioxopyrimidine portant deux groupements carbonyle en C2 et C4.

• La thymine est une 2,4-dioxo-5-méthylpyrimidine, c’est-à-dire un uracile portant un méthyle en C5.

💡 Astuce mémo

Purines à deux cycles, pyrimidines à un cycle

📖 3. Liaisons et nomenclature nucléotidiques

★ À maîtriser

• Le ribose est le pentose de l’ARN et porte quatre fonctions hydroxyles, tandis que le désoxyribose de l’ADN a perdu la fonction hydroxyle du carbone 2’.

• Dans les acides nucléiques, deux des trois fonctions acides du phosphate participent à des liaisons phosphoester et la troisième est sous forme O⁻, ce qui contribue à la charge négative de la molécule.

Compléments

• Les carbones du pentose sont numérotés de 1’ à 5’ pour les distinguer des carbones des bases azotées.

📌 La liaison β-N-osidique unit le carbone 1’ du sucre à l’azote 1 d’une base pyrimidique ou à l’azote 9 d’une base purique, du côté β du plan du sucre.

📌 La liaison phosphoester unit une fonction acide du phosphate à la fonction alcool portée par le carbone 5’ du sucre.

• Les liaisons β-N-osidique et phosphoester sont hydrolysables en milieu aqueux, ce qui régénère notamment la base azotée et le sucre.

📌 Le nucléoside d’une base purique prend le suffixe « -osine », celui d’une base pyrimidique le suffixe « -idine », et le préfixe « désoxy- » ou « d » indique un sucre désoxyribose.

📌 Le nucléotide est nommé à partir du nucléoside suivi du nombre de phosphates : monophosphate, diphosphate ou triphosphate.

📖 4. Polymérisation et polarité des chaînes

★ À maîtriser

• Les acides nucléiques sont des polymères de nucléotides liés par des liaisons phosphodiester 3’-5’, formées par deux liaisons phosphoester sur un même phosphate.

📌 La chaîne polynucléotidique s’écrit conventionnellement de 5’ vers 3’ ; l’extrémité 5’ marque le début et l’extrémité 3’ la fin, où le carbone 3’ est libre.

• La structure primaire d’un acide nucléique est l’ordre de ses bases, et sa structure secondo-tertiaire correspond à son organisation tridimensionnelle.

Compléments

• Les nucléotides ont leur sucre et leur base dans des plans perpendiculaires.

• Les nucléotides sont hydrophiles grâce au sucre et au phosphate, notamment aux fonctions alcool du sucre, et sont solubles dans l’eau.

• Les nucléotides absorbent les ultraviolets grâce aux noyaux aromatiques, ce qui permet de détecter ou de mesurer leur concentration en solution.

📌 La séquence d’un acide nucléique est notée par les initiales de ses bases dans le sens conventionnel 5’ vers 3’.

📖 5. Structure et propriétés de l’ADN

★ À maîtriser

• L’ADN contient du désoxyribose et les bases A, G, C et T, et se présente sous forme double brin.

📌 L’ADN est linéaire chez les eucaryotes et circulaire chez les procaryotes.

• Les deux chaînes d’ADN sont complémentaires, antiparallèles et hélicoïdales ; leurs orientations sont respectivement 5’-3’ et 3’-5’.

📌 Dans l’ADN, l’adénine s’apparie à la thymine par deux liaisons hydrogène et la guanine à la cytosine par trois liaisons hydrogène.

• Dans la double hélice d’ADN, le squelette sucre-phosphate hydrophile est en périphérie et les bases sont au centre, empilées en plans parallèles.

Compléments

• L’appariement purine-pyrimidine implique autant de bases puriques que pyrimidiques dans l’ADN, avec A/T = G/C = 1.

• L’axe de la double hélice d’ADN est perpendiculaire au plan des bases.

• La double hélice d’ADN est une hélice droite qui tourne dans le sens des aiguilles d’une montre et dont un tour comporte 10 paires de bases.

• La double hélice est stabilisée par :

  • les interactions hydrogène entre bases
  • les forces d’empilement
  • les interactions électroniques

💡 Astuce mémo

Une échelle torsadée : sucre-phosphate à l’extérieur, bases au centre

📖 6. Variations et accessibilité de l’ADN

★ À maîtriser

📌 L’ADN-B est la conformation majoritaire dans les conditions physiologiques, tandis que l’ADN-A apparaît lorsque les conditions d’hydratation sont modifiées ; les deux sont des hélices droites.

📌 L’ADN-Z est une double hélice gauche en zigzag, dont le pas est de 12 paires de bases et dont le grand sillon est aplati, presque inexistant.

• L’accessibilité des bases de l’ADN gouverne son rôle fonctionnel, notamment la transmission de messages sous forme d’ARN messagers et la reconnaissance de régions par des facteurs protéiques.

Compléments

• Le grand sillon de l’ADN est plus accessible aux protéines que le petit sillon.

• L’ADN dénaturé peut se renaturer si la cause dénaturante est supprimée, par exemple par refroidissement.

💡 Astuce mémo

B et A sont droites ; Z tourne à gauche

📖 7. Dénaturation et renaturation de l’ADN

🔑 Notions clés & Définitions

• Dénaturation : La disparition des interactions faibles, notamment hydrogène et électroniques, qui conduit à la séparation des brins de la double hélice.
• Température de fusion : La température à laquelle la moitié des molécules d’ADN sont dénaturées.

📝 Points essentiels

• La dénaturation peut être provoquée par :
  • des enzymes
  • une hausse de température
  • des solvants organiques
  • l’alcool
  • des pH extrêmes, notamment un milieu basique

💡 Astuce mémo

La chaleur rompt les interactions faibles → les brins se séparent

📖 8. Structure et appariement des ARN

★ À maîtriser

• L’ARN contient du ribose avec une fonction alcool sur le carbone 2’ et les bases A, G, C et U, l’uracile remplaçant la thymine.

• L’ARN est généralement monocaténaire et linéaire, mais sa complémentarité partielle intramoléculaire permet des repliements tridimensionnels préférentiels.

📌 Dans les régions appariées de l’ARN, les seules associations indiquées sont A-U et G-C, formées par des interactions hydrogène entre bases puriques et pyrimidiques.

Compléments

• Les motifs structuraux des ARN comprennent : des boucles, des épingles plus serrées, des régions hélicoïdales stabilisées par des liaisons hydrogène

📖 9. Principaux types d’ARN

★ À maîtriser

📌 Les ARNr s’associent à des protéines pour former les ribosomes et représentent 70 à 80 % des ARN ; les ARNt transportent les acides aminés et représentent 10 à 15 % ; les ARNm transmettent l’information génétique entre l’ADN et les protéines et représentent 1 à 5 %.

• Les ARNt mesurent 70 à 90 nucléotides et leur extrémité 3’ se termine toujours par CCA, où se lie spécifiquement l’acide aminé.

Compléments

• Les ARNr procaryotes sont de trois types : 16S, 5S et 23S.

• Chez les eucaryotes, l’ARNr 18S constitue la petite sous-unité 40S, tandis que les ARNr 5S, 5,8S et 28S contribuent à la grande sous-unité 60S.

• Les ARNr ont une taille variable, généralement comprise entre 100 et 5 000 nucléotides.

• Les ARNm ont une taille variable selon la longueur du gène, une séquence complémentaire du brin d’ADN matriciel et une durée de vie courte liée à leur fragilité.

📖 10. Structures des ARN spécialisés

🔑 Notions clés & Définitions

• Anticodon : Un triplet de nucléotides de l’ARNt qui reconnaît le codon de l’ARNm par appariement complémentaire et antiparallèle.

★ À maîtriser

📌 L’ARNt a une forme en trèfle lorsqu’il est déplié et une forme en boomerang dans sa conformation native, notamment en raison du repliement associé à ses bases atypiques.

• Les microARN sont de 21 à 24 nucléotides et participent à la régulation post-transcriptionnelle en favorisant la dégradation des ARNm ou la répression de leur traduction.

Compléments

• L’ARNm peut prendre plusieurs formes pour un même gène selon le type et l’état de la cellule, notamment après maturation et épissage alternatif post-transcriptionnel.

• Les ARNsn non codants, de 60 à 450 nucléotides, participent à la maturation des pré-ARNm en s’assemblant sur les introns, en permettant leur élimination et la suture des exons par épissage.

📖 11. Maturation et action des micro-ARN

📝 Points essentiels

• La maturation des micro-ARN comprend la transcription nucléaire des gènes en Pri-miRNA, la séparation des épingles à cheveux par un complexe enzymatique en Pré-miRNA, le passage dans le cytoplasme, la coupure de la boucle en duplex puis la séparation des deux brins.

📌 Après séparation du duplex, un brin de micro-ARN peut s’hybrider au début d’un ARNm et bloquer le passage du ribosome, tandis qu’un autre peut s’hybrider à certains ARNm et les cliver.

💡 Astuce mémo

Pri-miRNA nucléaire → Pré-miRNA → duplex cytoplasmique → blocage ou clivage

📖 12. Extraction et hydrolyse des acides nucléiques

★ À maîtriser

• L’extraction par chromatographie échangeuse d’ions comprend la lyse de l’échantillon, l’accrochage des acides nucléiques négatifs à un support positif, le lavage du support puis le décrochage et la récupération des acides nucléiques par variation du pH ou de la force ionique.

📌 L’ARN, simple brin et fragile, nécessite des précautions contre les ribonucléases, contrairement à l’ADN, pour lequel aucune précaution particulière n’est indiquée.

📌 Les exonucléases libèrent par hydrolyse le nucléotide situé à l’extrémité 3′ ou 5′ d’un acide nucléique, tandis que les endonucléases hydrolysent une liaison interne.

• Les endonucléases de restriction reconnaissent généralement des séquences palindromiques courtes de 4 à 6 nucléotides, parfois 8, identiques lorsqu’elles sont lues de 5′ vers 3′ sur les deux brins complémentaires.

📌 EcoRI reconnaît spécifiquement la séquence 5′-GAATTC-3′ et produit des extrémités cohésives, tandis que HaeIII reconnaît 5′-GGCC-3′ et produit des extrémités franches.

Compléments

• L’ADN et l’ARN sont fortement chargés négativement, car chaque groupement phosphate porte une charge négative.

• Les précautions de manipulation de l’ARN sont :

  • Porter des gants
  • Utiliser une solution sans ribonucléases
  • Employer des consommables jetables
  • Utiliser de la vaisselle lavée et traitée

• Les endonucléases peuvent couper sans spécificité ou reconnaître une séquence spécifique, comme les endonucléases de restriction.

• Les endonucléases de restriction sont d’origine bactérienne et participent à la protection contre les virus en clivant leur génome.

• Une électrophorèse peut vérifier une coupure par enzyme de restriction : l’échantillon non coupé forme une bande, tandis que l’échantillon coupé peut former plusieurs bandes plus petites qui migrent plus loin vers l’anode.

💡 Astuce mémo

Lyser → accrocher → laver → décrocher

📖 13. Hybridation, polymérases et PCR

🔑 Notions clés & Définitions

• Sonde : Petite séquence d’acide nucléique complémentaire et antiparallèle à la région cible, portant un élément de détection radioactif ou fluorescent.

★ À maîtriser

• L’hybridation d’une sonde comprend la dénaturation réversible de l’ADN par augmentation de la température ou modification du pH, puis l’appariement spécifique d’une sonde complémentaire et antiparallèle à la séquence cible lorsque la température diminue.

📌 Les ADN polymérases ADN-dépendantes utilisent une matrice d’ADN pour fabriquer de l’ADN, tandis que les ADN polymérases ARN-dépendantes utilisent une matrice d’ARN pour fabriquer de l’ADN.

• L’extension d’un brin d’ADN par une ADN polymérase se fait toujours dans le sens 5′ vers 3′.

• La synthèse d’ADN nécessite :

  • Une ADN polymérase
  • Une amorce d’ADN d’environ 20 nucléotides
  • Des désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP)
  • Une matrice d’ADN simple brin

• 🔄 Un cycle de PCR comprend trois étapes :

  1. Dénaturation thermique du double brin en deux brins simples
  2. Hybridation des amorces de part et d’autre du fragment cible
  3. Élongation des amorces par l’ADN polymérase

• Le facteur d’amplification théorique après n cycles de PCR est $2^{n}$, car la quantité d’ADN double à chaque cycle.

Compléments

• La Taq polymérase, ADN polymérase ADN-dépendante thermorésistante provenant de Thermus aquaticus, permet d’éviter l’ajout d’une nouvelle enzyme à chaque cycle de PCR.

• Après 30 cycles, le facteur théorique est $2^{30}$, tandis que l’amplification observée en pratique est comprise entre $10^{6}$ et $10^{8}$ en raison d’un rendement inférieur à 100 %.

• La PCR a été inventée par Kary Mullis, qui a reçu le prix Nobel de chimie en 1993.

• En PCR, la dénaturation a lieu jusqu’à 94 °C, l’hybridation des amorces à 60–65 °C et la synthèse à 72 °C, température optimale d’activité de la Taq polymérase.

💡 Astuce mémo

PCR : dénaturer → hybrider → élonger

📖 14. PCR-RFLP et drépanocytose

🔑 Notions clés & Définitions

• PCR-RFLP : Consiste à soumettre un fragment d’ADN amplifié par PCR à des enzymes de restriction, puis à observer la taille des fragments obtenus pour renseigner sur les séquences coupées ou non.

★ À maîtriser

• Une analyse PCR-RFLP comprend l’extraction de l’ADN, l’amplification du fragment cible par PCR, sa digestion par une enzyme de restriction choisie selon le site étudié, puis l’électrophorèse des fragments pour déterminer leur nombre et leur taille.

• Dans l’exemple de la drépanocytose, la mutation ponctuelle du codon 6 du gène de la chaîne β de l’hémoglobine remplace une adénine par une thymine.

📌 Dans l’exemple de la drépanocytose, DdeI coupe l’amplicon du gène normal en fragments de 168 pb et 93 pb, mais ne coupe pas l’amplicon du gène muté, qui reste long de 261 pb.

📌 En électrophorèse après PCR-RFLP, AA désigne l’individu homozygote sans mutation, SS l’individu homozygote portant la mutation sur les deux allèles et AS l’individu hétérozygote portant la mutation sur un seul allèle.

Compléments

• DdeI reconnaît la séquence 5′-C/TNAG-3′, où N représente n’importe quel nucléotide et la barre indique une coupure entre C et T.

💡 Astuce mémo

Ddel coupe l’allèle normal, mais pas l’allèle muté

📖 15. Quantification des ARN et PCR digitale

🔑 Notions clés & Définitions

• RT-PCR : Approche semi-quantitative de l’expression d’un gène qui associe la rétrotranscription des ARNm en ADNc à l’amplification de cet ADNc par PCR en temps réel.

★ À maîtriser

• La quantification des ARNm par RT-PCR comprend l’extraction des ARNm, leur rétrotranscription en ADNc par une transcriptase inverse, l’amplification de l’ADNc par PCR en temps réel et l’estimation de la concentration des échantillons à partir de leur Ct.

📌 En PCR en temps réel, le Ct est le nombre de cycles théoriques nécessaires pour atteindre le seuil de fluorescence défini, et il est inversement proportionnel à la quantité initiale d’ADNc.

Compléments

• La gamme étalon de PCR en temps réel peut comprendre quatre échantillons obtenus par dilutions successives d’un même échantillon, avec un facteur de dilution de 5 entre deux échantillons successifs.

• Dans une gamme de quatre dilutions successives au facteur 5, l’échantillon 4 est 125 fois plus dilué que l’échantillon 1.

• La PCR digitale compartimente l’échantillon en millions de microgouttelettes contenant sondes et amorces ; les gouttelettes fluorescentes signalent la présence de la séquence recherchée, ce qui permet une quantification absolue par comptage.

💡 Astuce mémo

Ct élevé = faible quantité initiale ; PCR digitale = comptage des gouttelettes

📖 16. Séquençage Sanger et nomenclature

🔑 Notions clés & Définitions

• Séquençage Sanger : Méthode enzymatique de terminaison de chaîne utilisant des didésoxynucléotides marqués, dont l’incorporation arrête l’élongation de l’ADN.

★ À maîtriser

• Un ddNTP est un désoxyribonucléotide dépourvu de groupement hydroxyle en 3′ ; une fois incorporé dans l’ADN, il empêche l’ajout du nucléotide suivant.

• La méthode de Sanger comprend la dénaturation de l’ADN, l’hybridation d’une amorce, l’élongation par l’ADN polymérase avec incorporation de dNTP ou de ddNTP terminateurs, puis la séparation des fragments selon leur taille par électrophorèse.

Compléments

• Dans la méthode de Sanger, les dNTP représentent 99 % du mélange et les ddNTP 1 %, ce qui produit des fragments de tailles variées.

📌 Avec des ddNTP radioactifs, la méthode de Sanger utilise quatre tubes, un par type de ddNTP, tandis qu’avec des ddNTP fluorescents, elle utilise un seul tube et distingue les bases par leur couleur.

• Les couleurs des ddNTP sont :

  • Vert pour A
  • Bleu pour C
  • Jaune ou noir pour G
  • Rouge pour T

• La notation p.Leu858Arg indique le remplacement de la leucine par l’arginine en position 858 de la séquence protéique.

• La notation c.2573T>G indique que, dans la séquence d’ADNc, la thymine en position 2573 est remplacée par une guanine.

💡 Astuce mémo

Sans OH en 3′, le ddNTP arrête l’élongation

📖 17. Séquençage de nouvelle génération

★ À maîtriser

• Le séquençage de nouvelle génération (NGS) est un séquençage par synthèse massivement parallèle, permettant d’analyser simultanément plusieurs régions et gènes ou plusieurs patients, avec une sensibilité supérieure à celle de Sanger.

• Le NGS comprend la fragmentation de l’ADN génomique, la ligation d’adaptateurs, l’hybridation sur une puce portant des amorces complémentaires, puis le séquençage par synthèse et l’analyse informatique des signaux.

Compléments

• En NGS, les nucléotides incorporés sont identifiés par leur couleur à chaque cycle, puis les images sont traitées informatiquement pour reconstituer les séquences, qui sont alignées sur une séquence de référence et utilisées pour repérer les anomalies.

💡 Astuce mémo

Fragmenter → adapter → fixer sur puce → séquencer par synthèse

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des acides nucléiques

Familles de bases azotées