Fiche de révision : Techniques d’analyse et de manipulation génétique

📋 Plan du Cours

1. Transfert et détection par Western blot
2. Protéines de fusion et étiquettes
3. Principe de l’immunoprécipitation
4. Interprétation de la co-immunoprécipitation
5. Stratégies de manipulation génétique
6. Silencement génique par les siRNA

📖 1. Transfert et détection par Western blot

★ À maîtriser

• Les protéines séparées sur le gel sont transférées sur une membrane de nitrocellulose par application d’un courant électrique et s’y fixent par des interactions hydrophobes et ioniques.

• Le Western blot consiste à incuber successivement la membrane avec un anticorps primaire puis un anticorps secondaire, en réalisant des lavages après chaque incubation.

📌 Le blocage de la membrane est indispensable pour limiter les interactions non spécifiques entre les anticorps et les sites libres de la membrane.

• Une protéine d’intérêt peut être identifiée après sa séparation sur un gel SDS-PAGE grâce à des anticorps spécifiques.

Compléments

• Lorsque l’anticorps secondaire est conjugué à une enzyme, l’ajout d’un substrat chimiluminescent produit un signal luminescent détectable par un système de chimiluminescence.

💡 Astuce mémo

Transférer, bloquer, sonder, laver, révéler

📖 2. Protéines de fusion et étiquettes

🔑 Notions clés & Définitions

• Protéine de fusion : Produite en fusionnant, par génie génétique, la séquence codant la protéine d’intérêt avec une petite séquence appelée étiquette ou Tag.
• GFP : Ou Green Fluorescent Protein, est une protéine issue d’une méduse qui émet naturellement une fluorescence verte lorsqu’elle est excitée par une lumière de longueur d’onde spécifique.

★ À maîtriser

• Le Tag est un petit épitope facilement reconnu par des anticorps commerciaux.

Compléments

• Les Tags FLAG, HIS, HA et Myc ont généralement une taille inférieure à 3 kDa, ce qui limite leur impact sur la structure et le poids moléculaire de la protéine d’intérêt.

• La GFP a un poids moléculaire d’environ 27 kDa et augmente donc significativement le poids moléculaire de la protéine de fusion.

💡 Astuce mémo

Petit Tag discret, GFP volumineuse et fluorescente

📖 3. Principe de l’immunoprécipitation

🔑 Notions clés & Définitions

• Immunoprécipitation : Méthode qui permet d’isoler et de purifier une protéine d’intérêt à partir d’une solution grâce à un anticorps spécifique qui entraîne sa précipitation.

★ À maîtriser

• Dans un lysat cellulaire, l’anticorps spécifique est incubé avec la protéine d’intérêt, puis la protéine A de Staphylococcus aureus est ajoutée pour se fixer à l’anticorps par affinité.

• Après centrifugation, le culot contenant le complexe immunoprécipité est conservé tandis que le surnageant est éliminé.

Compléments

• Le culot est solubilisé puis déposé sur un gel SDS-PAGE avant la réalisation d’un Western blot pour visualiser la protéine immunoprécipitée.

💡 Astuce mémo

Anticorps, protéine A, centrifugation, culot, Western blot

📖 4. Interprétation de la co-immunoprécipitation

🔑 Notions clés & Définitions

• Co-immunoprécipitation : Extension de l’immunoprécipitation qui permet d’étudier une interaction protéine-protéine.

📝 Points essentiels

• Lors de l’immunoprécipitation d’une protéine d’intérêt, les protéines qui lui sont associées sont également précipitées et peuvent être étudiées par électrophorèse et Western blot.

📌 Lorsque l’immunoprécipitation est réalisée avec deux protéines purifiées dans un contexte acellulaire, l’interaction observée entre elles peut être conclue comme directe, car aucune autre protéine intermédiaire n’est présente.

📌 Si la protéine Y est visualisée après l’immunoprécipitation de X, X et Y interagissent physiquement, mais cette interaction peut être directe ou indirecte dans un lysat cellulaire ou tissulaire total.

💡 Astuce mémo

Interaction physique ne signifie pas interaction directe

📖 5. Stratégies de manipulation génétique

★ À maîtriser

• Les manipulations génétiques visent à modifier l’expression d’un gène dans différents modèles vivants, notamment par inhibition avec un knock-out ou par augmentation avec un knock-in.

📌 Une manipulation génétique in vitro est réalisée dans une boîte de culture sur des cultures primaires ou des lignées cellulaires, tandis qu’une manipulation in vivo est réalisée dans un organisme vivant.

📌 Un knock-out total invalide le gène dans tout l’organisme, tandis qu’un knock-out tissu-spécifique ou cellule-spécifique restreint cette invalidation à un tissu entier ou à certaines cellules d’un tissu.

Compléments

📌 Un knock-out conditionnel invalide un gène dans des conditions précises à partir d’un stade donné du développement, stratégie qui implique souvent l’ajout de dexaméthasone dans l’eau de boisson.

• Les manipulations in vivo peuvent être réalisées sur un embryon ou un animal adulte, dans tout l’organisme, dans un tissu ou une cellule spécifique, ou à un stade de développement donné.

💡 Astuce mémo

KO diminue, KI augmente l’expression

📖 6. Silencement génique par les siRNA

🔑 Notions clés & Définitions

• siRNA : Ou small interfering RNA, est un petit ARN interférent double brin non codant d’environ 20 nucléotides, capable de se lier spécifiquement à une séquence d’ARNm cible.

★ À maîtriser

• Après sa transfection par des vésicules lipidiques, le siRNA est libéré dans le cytoplasme et s’associe au complexe multiprotéique RISC.

• La fixation du siRNA à RISC sépare ses deux brins ; le brin passager est éliminé tandis que le brin guide reste associé au complexe.

• Le brin guide associé à RISC reconnaît l’ARNm cible par complémentarité, puis RISC le clive dans le cytoplasme.

📌 L’ARNm clivé est dégradé par les enzymes cellulaires et n’est donc pas traduit en protéine, tandis que le complexe RISC-siRNA reste intact et peut cliver un autre ARNm cible.

Compléments

• In vivo, les siRNA sont injectés par voie intraveineuse dans des polyplexes qui les protègent dans le sang, facilitent leur entrée cellulaire, puis sont internalisés par endocytose avant de libérer le siRNA dans le cytoplasme.

💡 Astuce mémo

Transfecter, charger RISC, guider, cliver, dégrader

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des manipulations génétiques