Fiche de révision : Techniques de biologie moléculaire

📋 Plan du Cours

1. Extraction et purification des acides nucléiques
2. Hydrolyse par les nucléases
3. Enzymes de restriction et fragments
4. Hybridation et sondes moléculaires
5. ADN polymérases et synthèse in vitro
6. PCR et amplification de l’ADN
7. Électrophorèse des acides nucléiques
8. PCR-RFLP et détection des mutations
9. RT-PCR et quantification en temps réel
10. PCR digitale et quantification absolue

📖 1. Extraction et purification des acides nucléiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Extraction des acides nucléiques : Récupération et isolement des acides nucléiques à partir d’un échantillon contenant des cellules, à l’exception des globules rouges qui ne contiennent pas d’ADN.

📝 Points essentiels

• L’extraction des acides nucléiques comprend successivement la lyse des protéines, la fixation de l’ADN ou de l’ARN sur un support chargé positivement, le lavage du support et l’élution par modification du pH ou de la charge ionique.

📌 L’ADN est très stable, tandis que l’ARN est facilement dégradé par les ribonucléases présentes notamment sur la peau et nécessite des précautions supplémentaires lors de son extraction.

💡 Astuce mémo

Lyser → fixer → laver → éluer

📖 2. Hydrolyse par les nucléases

🔑 Notions clés & Définitions

• Nucléases : Hydrolases, plus précisément des estérases, qui hydrolysent la liaison phosphoester entre le sucre et le groupement phosphate des acides nucléiques.

★ À maîtriser

📌 Les DNases hydrolysent l’ADN, tandis que les RNases hydrolysent l’ARN.

📌 Les exonucléases hydrolysent un nucléotide depuis une extrémité de l’acide nucléique, tandis que les endonucléases hydrolysent une liaison entre deux nucléotides à l’intérieur de la séquence.

Compléments

• Les 5’-exonucléases ciblent l’extrémité 5’ phosphate et les 3’-exonucléases ciblent l’extrémité 3’ hydroxyle, en libérant un nucléotide monophosphate à chaque coupure.

💡 Astuce mémo

Exonucléase = extrémité ; endonucléase = intérieur

📖 3. Enzymes de restriction et fragments

🔑 Notions clés & Définitions

• Enzymes de restriction : Endonucléases spécifiques produites naturellement par les bactéries pour hydrolyser le génome de certains virus infectieux sans dégrader le génome bactérien producteur.

★ À maîtriser

📌 Une enzyme de restriction reconnaît une séquence précise de 4 à 6 paires de bases, souvent palindromique, et hydrolyse une liaison phosphoester sur chacun des deux brins si la séquence correspond exactement.

📌 Une digestion par enzyme de restriction produit des extrémités cohésives lorsqu’un brin dépasse et peut s’apparier par complémentarité, tandis qu’elle produit des extrémités franches lorsque la complémentarité terminale n’est plus possible.

Compléments

• Dans la nomenclature d’une enzyme de restriction, les premières lettres indiquent le genre et l’espèce bactérienne, la lettre suivante indique la souche et le chiffre romain indique l’ordre de découverte.

💡 Astuce mémo

Des ciseaux bactériens découpent une séquence précise

📖 4. Hybridation et sondes moléculaires

🔑 Notions clés & Définitions

• Sonde : Petite séquence d’ADN conçue pour être complémentaire et antiparallèle à la séquence nucléotidique à détecter.

★ À maîtriser

• La détection par sonde comprend la dénaturation de l’ADN, l’hybridation spécifique de la sonde sur le brin complémentaire et la détection du marquage de la sonde.

Compléments

• Les sondes peuvent être marquées par un isotope radioactif tel que le ³²P ou par un fluorophore afin de visualiser spécifiquement le fragment où elles sont hybridées.

💡 Astuce mémo

Dénaturer → hybrider → détecter

📖 5. ADN polymérases et synthèse in vitro

🔑 Notions clés & Définitions

• ADN polymérase : Enzyme qui synthétise un brin d’ADN complémentaire d’un brin matrice à partir d’une amorce.

📝 Points essentiels

📌 Toutes les polymérases synthétisent l’acide nucléique dans le sens 5’ vers 3’ en ajoutant les nucléotides à l’extrémité 3’ de l’amorce ou du brin en formation.

📌 Les ADN polymérases ADN-dépendantes utilisent une matrice d’ADN, tandis que les ADN polymérases ARN-dépendantes utilisent une matrice d’ARN et synthétisent l’ADN correspondant.

• La synthèse in vitro nécessite:
  • Une matrice simple brin
  • Une amorce
  • Des dNTP
  • Une ADN polymérase

💡 Astuce mémo

La sonde détecte, l’amorce démarre

📖 6. PCR et amplification de l’ADN

🔑 Notions clés & Définitions

• PCR : Réaction de polymérisation en chaîne qui amplifie une séquence d’ADN grâce à une ADN polymérase ADN-dépendante.

★ À maîtriser

• Chaque cycle de PCR comprend la dénaturation de l’ADN à 94 °C, l’hybridation des amorces à 60–65 °C et l’élongation à 72 °C.

• Chaque cycle de PCR double théoriquement la quantité d’ADN, selon le facteur d’amplification $2^n$ après n cycles.

Compléments

• La Taq polymérase, isolée initialement chez Thermus aquaticus, est thermorésistante et supporte les températures élevées de dénaturation utilisées pendant les cycles de PCR. — Kary Mullis

💡 Astuce mémo

94 °C → 60–65 °C → 72 °C

📖 7. Électrophorèse des acides nucléiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Électrophorèse : Séparation des acides nucléiques selon leur longueur par migration dans un champ électrique continu.

★ À maîtriser

📌 Les acides nucléiques chargés négativement sont déposés près de la cathode négative et migrent vers l’anode positive.

📌 Les fragments d’acides nucléiques courts migrent plus loin et plus rapidement que les fragments longs.

Compléments

• Un marqueur de taille permet de comparer les bandes d’acides nucléiques à des bandes de référence de taille connue après révélation par coloration et observation sous UV.

💡 Astuce mémo

Court migre loin ; long migre moins loin

📖 8. PCR-RFLP et détection des mutations

🔑 Notions clés & Définitions

• PCR-RFLP : Détecte un polymorphisme de longueur de fragments de restriction après amplification PCR et digestion enzymatique.

★ À maîtriser

• 🔄 Une PCR-RFLP comprend quatre étapes:
  1. Extraction de l’ADN
  2. Amplification PCR de la séquence étudiée
  3. Hydrolyse de l’amplicon par une enzyme de restriction
  4. Électrophorèse des fragments

📌 Si l’enzyme découpe l’amplicon, plusieurs fragments plus courts sont observés, tandis que l’absence de digestion laisse un fragment de la longueur initiale.

Compléments

• Dans l’exemple de la drépanocytose, le profil normal homozygote présente des bandes à 168 pb et 93 pb, le profil muté homozygote une bande à 261 pb et le profil hétérozygote les trois bandes.

💡 Astuce mémo

Extraire → amplifier → digérer → séparer

📖 9. RT-PCR et quantification en temps réel

🔑 Notions clés & Définitions

• RT-PCR : Étudie l’expression d’un gène en convertissant son ARNm en ADN complémentaire, puis en amplifiant cet ADNc par PCR.

★ À maîtriser

• La rétrotranscription nécessite:
  • Une matrice ARN
  • Une amorce
  • Des dNTP
  • Une ADN polymérase ARN-dépendante

📌 Le Ct est inversement proportionnel au logarithme de la concentration initiale en ARNm : plus la concentration est élevée, plus le Ct est faible.

📌 En PCR quantitative en temps réel, la concentration initiale en ARNm est estimée à partir du nombre de cycles nécessaires pour atteindre un seuil de fluorescence, appelé Ct.

Compléments

• Une différence d’un cycle de Ct entre deux échantillons signifie que la quantité initiale d’ARNm est deux fois plus faible dans l’échantillon ayant le Ct le plus élevé.

💡 Astuce mémo

Plus d’ARNm initial → Ct plus faible

📖 10. PCR digitale et quantification absolue

🔑 Notions clés & Définitions

• PCR digitale : Quantifie absolument les copies d’un gène en compartimentant l’échantillon dans des milliers de gouttelettes ou de puits, puis en comptant les compartiments fluorescents.

★ À maîtriser

• La PCR digitale comprend la compartimentalisation de l’échantillon, la réalisation de la PCR dans chaque compartiment et le comptage des compartiments positifs avec un calcul fondé sur la loi de Poisson.

Compléments

• Une gouttelette de PCR digitale peut contenir aucune copie d’acide nucléique, une seule copie ou, plus rarement, plusieurs copies.

• Les sondes TaqMan s’hybrident spécifiquement à l’ADN simple brin et produisent une fluorescence lors de l’élongation si le gène cible est présent.

💡 Astuce mémo

Compartimenter → amplifier → compter

📊 Tableaux de synthèse

Sonde et amorce