Fiche de révision : Techniques d’étude de la cellule

📋 Plan du Cours

1. Microscopie optique
2. Microscopie électronique
3. Préparation par coupes
4. Cryofracture membranaire
5. Purification cellulaire
6. Étude fonctionnelle de la cellule

📖 1. Microscopie optique

🔑 Notions clés & Définitions

• Microscope à fluorescence : Visualise et localise des composés cellulaires marqués par une sonde fluorescente ou un fluorochrome.
• Microscope confocal : Est un microscope à fluorescence utilisant un faisceau laser focalisé à une profondeur donnée, ce qui permet d’obtenir des images précises de chaque plan et de construire des images en 3D.

★ À maîtriser

• Le microscope optique, ou microscope photonique, utilise un faisceau de photons, des lentilles de verre et un échantillon très fin pour observer des cellules vivantes ou des tissus fixés.

• Le microscope optique possède une résolution de 0,2 µm et un grossissement maximal de 1000 fois.

Compléments

• Lorsqu’un fluorochrome absorbe une longueur d’onde donnée, il émet une lumière de longueur d’onde supérieure après retour de son électron vers son orbite initiale.

💡 Astuce mémo

Fluorescence pour localiser, contraste de phase pour visualiser le relief

📖 2. Microscopie électronique

📝 Points essentiels

• Le microscope électronique à transmission utilise un faisceau d’électrons traversant l’échantillon et des bobines magnétiques comme lentilles pour observer des ultrastructures cellulaires.

• Le MET possède une résolution de 0,2 nm et un grossissement maximal d’un million de fois.

• Le microscope électronique à balayage possède une résolution de 10 nm et est principalement réservé à l’examen de cellules intactes.

• Le MEB balaie la surface métallisée de l’échantillon, mesure les électrons réfléchis avec un détecteur et construit une image en 3D.

💡 Astuce mémo

MET traverse l’échantillon, MEB balaie sa surface

📖 3. Préparation par coupes

📝 Points essentiels

📌 Les cellules vivantes peuvent être coupées sans traitement pour une observation au microscope optique uniquement, tandis que les tissus fixés peuvent être observés au microscope optique ou électronique après coupe ultrafine.

• La préparation d’un tissu pour une coupe ultrafine consiste à le fixer chimiquement, à l’inclure dans une résine, à le couper au microtome puis à le contraster.

💡 Astuce mémo

Fixer → inclure → couper → contraster

📖 4. Cryofracture membranaire

📝 Points essentiels

• La cryofracture sépare les deux feuillets d’une bicouche lipidique en congelant l’échantillon, en le fracturant sous vide, en réalisant une réplique métallique et carbonée, en digérant la matière organique puis en observant les plans de fracture au MET.

• Les plans de fracture correspondent aux zones de moindre résistance, situées entre les deux feuillets de la bicouche lipidique, et révèlent que des protéines membranaires y sont enchâssées.

💡 Astuce mémo

Congeler → fracturer → répliquer → digérer → observer

📖 5. Purification cellulaire

★ À maîtriser

📌 Le fractionnement cellulaire sépare les constituants par centrifugations, tandis que la cytométrie de flux sépare des catégories de cellules selon la présence ou l’absence d’une molécule recherchée.

📌 La centrifugation différentielle sépare les constituants selon leur masse grâce à une série de centrifugations à vitesse croissante, tandis que la centrifugation en gradient sépare selon la densité.

Compléments

• Un gradient de saccharose permet de séparer des organites, tandis qu’un gradient de chlorure de césium permet de séparer des molécules d’ADN.

💡 Astuce mémo

Centrifugation différentielle selon la masse, gradient selon la densité

📖 6. Étude fonctionnelle de la cellule

★ À maîtriser

📌 La cytochimie directe reconnaît directement un constituant cellulaire, la cytoenzymologie reconnaît l’activité d’une enzyme et l’immunocytochimie reconnaît une protéine par un anticorps.

• Les colorants permettent d’identifier notamment:

  • Lugol : amidon et glycogène
  • Rouge soudan III : lipides
  • Carmin aluné : cellulose
  • Vert d’iode : lignine et subérine
  • Vert de méthyle : ADN
  • Pyronine : ARN
  • Rouge neutre : vacuole
  • Coloration de Gram : paroi bactérienne

• La coloration de Gram donne une coloration violette aux bactéries Gram positif et une coloration rose aux bactéries Gram négatif.

• L’autoradiographie localise une molécule marquée par un isotope radioactif, dont le rayonnement réduit les ions Ag⁺ en argent métallique opaque aux électrons, formant des grains d’argent au niveau de la molécule au MET.

• La cytoenzymologie consiste à incuber les cellules dans un substrat que l’enzyme transforme en un produit coloré ou opaque aux électrons, comme le phosphate de plomb.

📌 L’immunocytochimie directe utilise un anticorps marqué qui se fixe directement sur la protéine recherchée, tandis que l’immunocytochimie indirecte utilise un anticorps secondaire marqué fixé sur un anticorps primaire et amplifie le signal.

Compléments

• Les marqueurs couplés aux anticorps sont:
  • Un fluorochrome
  • Une enzyme
  • Une particule opaque aux électrons
  • Une molécule radioactive

💡 Astuce mémo

Cytochimie directe reconnaît un constituant, cytoenzymologie une activité, immunocytochimie une protéine

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des microscopes