Fiche de révision : Techniques d’étude de la cellule

📋 Plan du Cours

1. Ultrastructure cellulaire au MET
2. Lumière et résolution microscopique
3. Variantes de microscopie
4. Préparation des échantillons
5. Fractionnement et marquage cellulaire
6. Cultures et analyse des cellules

📖 1. Ultrastructure cellulaire au MET

🔑 Notions clés & Définitions

• Polysomes : Assemblages de plusieurs ribosomes le long d’un ARNm, permettant la traduction simultanée d’une protéine en plusieurs exemplaires.

★ À maîtriser

• Au MET, l’enveloppe nucléaire comprend deux membranes séparées par un espace périclastique et percées de pores permettant les échanges entre nucléoplasme et cytoplasme.

• Le noyau contient la chromatine, constituée d’ADN actif ou condensé, et un ou plusieurs nucléoles où sont synthétisés les ARNr.

• Le réticulum endoplasmique granulaire est constitué de citernes aplaties tapissées de ribosomes et assure la synthèse des protéines membranaires et des protéines d’exportation.

• La mitochondrie possède une membrane externe et une membrane interne repliée en crêtes ; sa matrice contient l’ADN mitochondrial et des enzymes du cycle de Krebs, et l’organite est le siège de la respiration cellulaire et de la production d’ATP.

Compléments

• L’appareil de Golgi comprend : des dictyosomes formés de piles de sacs, des vésicules de transition, des citernes golgiennes, des vésicules de sécrétion ou grains de zymogène

📖 2. Lumière et résolution microscopique

🔑 Notions clés & Définitions

• Limite de résolution : Distance minimale en deçà de laquelle deux points apparaissent confondus.

★ À maîtriser

• La lumière visible, ou lumière blanche, est un mélange de radiations de longueurs d’onde différentes, allant d’environ 380 nm pour le violet à 700 nm pour le rouge.

• Dans un microscope photonique, la lumière traverse l’objet puis les lentilles de l’objectif et de l’oculaire, qui forment sur la rétine une image agrandie et inversée.

📐 Formule - La limite de résolution vérifie $d = \frac{0{,}61\lambda}{n\sin(u)}$, et le pouvoir séparateur vérifie $PR = \frac{1}{d}$.

Compléments

• Plus la longueur d’onde λ est petite, plus l’énergie du photon est grande.

• La résolution peut être améliorée par : la diminution de λ, l’augmentation de l’indice de réfraction n, l’augmentation de l’ouverture numérique sin(u)

• L’huile de cèdre, d’indice de réfraction n ≈ 1,5, peut remplacer l’air, d’indice n = 1, entre la lame et l’objectif.

💡 Astuce mémo

Quand λ diminue, l’énergie du photon augmente.

📖 3. Variantes de microscopie

★ À maîtriser

📌 Le contraste de phase et le contraste de Nomarski convertissent les différences d’indice de réfraction en contrastes lumineux, facilitant l’observation sans coloration de cellules vivantes et transparentes avec un effet de relief.

• La microscopie confocale utilise des fluorochromes excités par des UV et un diaphragme qui élimine la lumière hors du plan focal, permettant des coupes optiques très fines et une reconstruction 3D.

📌 Le MET fait traverser à un faisceau d’électrons une ultra-coupe de moins de 0,1 μm contrastée par des métaux lourds comme l’uranium ou le plomb, et produit une image interne en 2D de l’ultrastructure.

📌 Le MEB balaie la surface d’un échantillon métallisé à l’or ou au platine et produit une image extérieure en 3D des reliefs cellulaires.

Compléments

• En microscopie à fond noir, la lumière arrive obliquement et seule la lumière diffusée par les particules est visible, sous forme de structures lumineuses sur fond sombre.

• La spectrométrie X analyse les photons X émis lors du bombardement électronique afin d’établir un spectre élémentaire chimique qualitatif et quantitatif.

💡 Astuce mémo

Le MET traverse l’échantillon ; le MEB balaie sa surface.

📖 4. Préparation des échantillons

★ À maîtriser

• La préparation d’un échantillon pour la microscopie photonique comprend la fixation chimique au formol ou à l’alcool, ou physique par congélation, puis la déshydratation, l’inclusion dans la paraffine, la coupe au microtome et la coloration.

• La préparation d’un échantillon pour le MET comprend la fixation aux aldéhydes et à l’osmium, la déshydratation, l’inclusion dans des résines plastiques, la réalisation d’ultra-coupes sur grille de cuivre et le contraste aux sels de métaux lourds.

Compléments

• Pour la microscopie photonique, le microtome réalise des rubans de coupes fines de 5 μm.

• Les colorations en microscopie photonique utilisent notamment le bleu de méthylène ou l’hématoxyline-éosine pour contraster les structures.

• Pour le MET, les ultra-coupes ont une épaisseur inférieure ou égale à 0,1 μm.

📌 La coloration négative rend les petits objets isolés, comme les virus, clairs sur un fond sombre, tandis que la cryofracture permet d’observer l’intérieur des membranes.

💡 Astuce mémo

Fixer, déshydrater, inclure, couper, colorer.

📖 5. Fractionnement et marquage cellulaire

★ À maîtriser

• La centrifugation différentielle sépare les organites par augmentations progressives de la vitesse : 1 000 g sédimente les noyaux, 20 000 g les mitochondries et les lysosomes, et 80 000 g les microsomes.

• 🔄 Le trajet suivi par les protéines est (Jamieson et Palade) :

  1. le REG
  2. le Golgi
  3. les grains de zymogène
  4. l’exocytose

• Les anticorps spécifiques peuvent être couplés : à une enzyme, à de l’or colloïdal pour le MET, à un fluorochrome comme la fluorescéine ou la rhodamine

Compléments

• La centrifugation en gradient de densité de saccharose sépare les organites selon leur densité propre.

• L’autoradiographie utilise des isotopes radioactifs instables tels que ³H, ¹⁴C et ³⁵S, qui impressionnent une émulsion photographique et produisent des grains d’argent.

• La protéine GFP, issue d’une méduse, peut être exprimée par transgenèse afin d’observer in vivo le déplacement et l’expression des protéines dans des cellules vivantes.

💡 Astuce mémo

Pulse-chase : REG → Golgi → grains de zymogène → exocytose.

📖 6. Cultures et analyse des cellules

🔑 Notions clés & Définitions

• Lignée cellulaire : Constituée de cellules ayant acquis une capacité de division infinie par immortalisation spontanée ou par oncogènes.

★ À maîtriser

📌 Les cultures en suspension concernent les cellules libres et s’arrêtent lorsque le milieu est épuisé, tandis que les cultures sur support concernent les cellules adhérentes et s’arrêtent à l’état de confluence.

• Les conditions de culture comprennent : une asepsie rigoureuse, notamment sous hotte à flux laminaire, un milieu nutritif tamponné contenant du glucose, des acides aminés et des facteurs de croissance, une étuve à 37 °C

Compléments

• L’isolement de cellules à partir d’un tissu utilise des enzymes, notamment la collagénase et la protéase, pour détruire la matrice extracellulaire.

• La cytométrie de flux analyse et trie rapidement les cellules marquées par fluorescence lorsqu’elles traversent un faisceau laser.

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des microscopes électroniques

Cultures cellulaires