Fiche de révision : Méthodes d’analyses tissulaires

📋 Plan du Cours

1. Fondements de l’histologie
2. Échelles et résolution du vivant
3. Principe de la microscopie
4. Microscopies optique et électronique
5. Transmission et balayage électroniques
6. Fixation et inclusion des tissus
7. Coupe et préparation microscopique
8. Colorations histologiques
9. Immunomarquages et hybridation
10. Applications diagnostiques des marquages

📖 1. Fondements de l’histologie

🔑 Notions clés & Définitions

• Histologie : Discipline qui étudie et décrit les tissus et l’ultrastructure cellulaire à partir de préparations marquées et observées.

★ À maîtriser

• Theodor Schwann et Rudolf Virchow sont présentés comme les deux pères de l’histologie grâce à la théorie cellulaire, tandis que Camillo Golgi a découvert l’appareil de Golgi et décrit l’ultrastructure de certaines cellules neuronales.

• 🔄 L’organisation du vivant suit une succession hiérarchique:

  1. Les cellules forment des tissus
  2. Les tissus forment des organes
  3. Les organes forment des systèmes ou appareils

Compléments

• Le terme « histologie » vient de l’unification de « Histos », qui signifie tissu, et « Logos », qui signifie science, et il est utilisé depuis le XIXe siècle.

• Marcello Malpighi a commencé à étudier les tissus vivants au XVIIe siècle avec un microscope rudimentaire et a observé et décrit les capillaires pulmonaires.

💡 Astuce mémo

Cellule → tissu → organe → système

📖 2. Échelles et résolution du vivant

★ À maîtriser

• La capacité résolutive de l’œil humain est d’environ 200 μm, celle du microscope optique est d’environ 200 nm, et celle de la microscopie électronique peut atteindre environ 0,2 nm.

📌 L’œil humain observe les organes et certains prélèvements, le microscope optique observe notamment les lobules, les travées et les cellules, tandis que le microscope électronique permet d’observer les organites et l’échelle nucléosomale.

Compléments

• Dans l’exemple du foie, l’œil observe un foie d’environ 25 cm et une lame d’hépatectomie d’environ 2 cm, le microscope optique observe un lobule d’environ 1 mm et le microscope électronique peut observer des mitochondries d’environ 500 nm et des nucléosomes d’environ 15 nm.

💡 Astuce mémo

Œil pour le macroscopique, microscope pour l’invisible

📖 3. Principe de la microscopie

🔑 Notions clés & Définitions

• Résolution : Distance minimale séparant deux points qui peuvent être individualisés.

★ À maîtriser

📐 Formule — La résolution est décrite par l’équation d’Airy $d = \frac{0{,}61\lambda}{n\sin\alpha}$, où λ est la longueur d’onde, n l’indice de réfraction et α le demi-angle des rayons entrant dans l’objectif.

📌 La résolution s’améliore lorsque la longueur d’onde λ diminue ou lorsque l’angle α augmente.

Compléments

• En microscopie optique, la longueur d’onde est d’environ 600 nm et la résolution maximale est d’environ 0,2 μm.

• En microscopie électronique, une tension d’accélération de 100 kV donne une longueur d’onde d’environ 0,0037 nm et une tension de 200 kV donne environ 0,0025 nm, pour une résolution d’environ 0,3 nm.

💡 Astuce mémo

λ diminue ou α augmente → résolution améliorée

📖 4. Microscopies optique et électronique

★ À maîtriser

• Un microscope fait traverser un rayonnement à travers un échantillon puis un système de lentilles afin de former une image agrandie.

• La microscopie optique utilise des photons, tandis que la microscopie électronique utilise des électrons.

• En microscopie optique, les lentilles sont en verre et le grossissement est modifié en changeant l’objectif, tandis qu’en microscopie électronique les lentilles sont électromagnétiques et le grossissement est modifié par la lentille projecteur.

• L’échantillon peut être non déshydraté et l’observation est non destructrice en microscopie optique, alors que l’échantillon doit être déshydraté et le faisceau électronique est destructeur en microscopie électronique.

Compléments

• Le microscope optique mesure environ 30 à 40 cm de haut et 20 cm de large et peut tenir sur un bureau, tandis que le microscope électronique mesure environ 2 m de large et 2 m de haut et nécessite une pièce dédiée.

💡 Astuce mémo

Photon et verre en MO, électron et électromagnétisme en ME

📖 5. Transmission et balayage électroniques

📝 Points essentiels

• En microscopie électronique à transmission, les électrons traversent l’échantillon et produisent une image en deux dimensions, tandis qu’en microscopie électronique à balayage les électrons se réfléchissent sur la surface et permettent une visualisation en trois dimensions.

• La MET utilise une tension d’accélération supérieure à celle de la MEB et possède donc une résolution plus élevée, tandis que la MEB a une résolution d’environ 1 nm.

• Lors d’une diffusion inélastique, l’électron incident transfère de l’énergie, est faiblement dévié et produit une zone claire, tandis que lors d’une diffusion élastique il est fortement dévié sans transfert d’énergie et produit une zone sombre.

💡 Astuce mémo

MET traverse en 2D, MEB balaie la surface en 3D

📖 6. Fixation et inclusion des tissus

🔑 Notions clés & Définitions

• Fixation : Étape qui empêche la dégradation intrinsèque ou extrinsèque du tissu et permet son durcissement.

★ À maîtriser

• L’inclusion en paraffine transforme un prélèvement tissulaire en bloc suffisamment rigide pour être coupé.

Compléments

• La fixation au formol repose sur une réaction de réticulation des protéines par les groupements aldéhydes, formant un réseau qui limite leurs réactions et leur dégradation.

📌 La déshydratation élimine l’eau grâce à des bains d’éthanol allant d’environ 60 % jusqu’à l’éthanol anhydre à 100 %, ce qui permet ensuite l’utilisation du xylène.

💡 Astuce mémo

Fixer → déshydrater → clarifier → imprégner → bloquer

📖 7. Coupe et préparation microscopique

🔑 Notions clés & Définitions

• Lame blanche : Lame portant de la paraffine et du tissu inclus, mais dont les tissus sont peu visibles faute de contraste colorimétrique.

★ À maîtriser

• Le microtome permet de réaliser dans un bloc de paraffine des coupes successives de 3 à 5 μm d’épaisseur.

Compléments

• Les bandelettes de paraffine sont étalées sur un bain d’eau puis récupérées sur une lame de verre afin d’éviter les plis.

• Pour la microscopie électronique, l’échantillon est inclus dans une résine dure, coupé à l’ultramicrotome avec une épaisseur d’environ 80 nm, puis contrasté par des métaux lourds comme le citrate de plomb ou l’acétate d’uranyle.

💡 Astuce mémo

Microtome → bain d’eau → lame blanche

📖 8. Colorations histologiques

★ À maîtriser

📌 L’hématoxyline colore en bleu-violet les compartiments acides basophiles, tandis que l’éosine colore en rouge-rosé les compartiments basiques éosinophiles ou acidophiles.

• La coloration Hématoxyline-Éosine-Safran ajoute à l’hématoxyline et à l’éosine un safran jaune-orangé qui fixe surtout les tissus conjonctifs.

• La coloration PAS met en évidence certains mucopolysaccharides en magenta et permet notamment de visualiser le mucus et le revêtement du plateau strié intestinal.

Compléments

• Le trichrome de Masson colore les noyaux et substances basophiles en bleu-violet, le cytoplasme en rouge foncé et les tissus conjonctifs en bleu pâle.

• La coloration de Van Giesson colore les cellules musculaires en jaune et le collagène en rouge, tandis que l’orcéine met en évidence les fibres élastiques en brun.

💡 Astuce mémo

Hématoxyline basophile bleue, éosine acidophile rouge

📖 9. Immunomarquages et hybridation

🔑 Notions clés & Définitions

• Immunohistologie : Utilise des anticorps dirigés spécifiquement contre des protéines afin de les détecter dans un tissu.
• Hybridation in situ : Utilise des sondes nucléotidiques complémentaires d’une séquence spécifique d’ADN ou d’ARN afin de la détecter dans un tissu.

★ À maîtriser

📌 Dans un marquage direct, l’anticorps primaire porte la molécule reportrice, tandis que dans un marquage indirect l’anticorps secondaire reconnaît l’anticorps primaire et porte le système de détection.

📌 En immunohistochimie, une enzyme portée par l’anticorps secondaire, comme la HRP, transforme la DAB soluble en précipité insoluble au site de fixation de l’anticorps primaire.

• En immunofluorescence, un fluorochrome est excité à une longueur d’onde donnée puis émet des photons lorsqu’il revient à son état fondamental.

Compléments

• Le fluorochrome Alexa 488 est excité par des photons à 488 nm et émet des photons à 535 nm dans le vert.

💡 Astuce mémo

Anticorps pour les protéines, sondes pour les acides nucléiques

📖 10. Applications diagnostiques des marquages

🔑 Notions clés & Définitions

• Artéfact : Altération de l’observation causée par la technique de préparation et qui ne doit pas être interprétée comme une caractéristique réelle du tissu.

★ À maîtriser

📌 Un marquage positif de la cytokératine 20 et un marquage négatif de la cytokératine 7 orientent une métastase hépatique vers une tumeur primitive colique.

📌 Dans l’exemple du cancer du sein, des récepteurs aux œstrogènes et à la progestérone positifs avec un oncogène HER2 négatif orientent vers une prise en charge par hormonothérapie.

Compléments

📌 Un marquage positif de PD-L1 dans une biopsie pulmonaire peut rendre une tumeur éligible à l’immunothérapie et indiquer une probabilité accrue de réponse.

• En microscopie électronique, les anticorps secondaires peuvent porter des billes d’or denses aux électrons, ce qui rend très sombres les cellules qui les fixent.

• En hybridation in situ, l’ADN est d’abord dénaturé par ébullition, puis des sondes fluorescentes complémentaires s’hybrident aux séquences cibles lors du refroidissement.

💡 Astuce mémo

Marquage positif → cible identifiée → traitement orienté

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des microscopes