Fiche de révision : Culture cellulaire

📋 Plan du Cours

1. Intérêt et définition de la culture cellulaire
2. Sources et obtention des cellules
3. Purification et tri cellulaire
4. Mise en culture et entretien
5. Dénombrement et viabilité cellulaire
6. Cultures primaires et lignées cellulaires
7. Conditions de culture cellulaire
8. Co-cultures et supports tridimensionnels
9. Contraintes mécaniques et ingénierie tissulaire
10. Organoïdes et analyses cellulaires

📖 1. Intérêt et définition de la culture cellulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Culture cellulaire : Ensemble des techniques permettant de faire croître des cellules hors de l’organisme ou de leur milieu d’origine, à des fins scientifiques, diagnostiques ou médicales.

📝 Points essentiels

• La culture cellulaire permet d’étudier le cycle cellulaire, l’expression des gènes, le métabolisme et les fonctions cellulaires, ainsi que de développer des cibles thérapeutiques.

• Les applications médicales comprennent:

  • les autogreffes
  • l’ingénierie cellulaire et tissulaire
  • le dépistage d’anomalies chromosomiques
  • la thérapie génique ou cellulaire
  • la fécondation in vitro

📌 La culture cellulaire facilite l’obtention de cellules homogènes et le contrôle des conditions expérimentales, mais l’isolement des cellules modifie leurs communications et peut altérer leur comportement par rapport à l’organisme.

📖 2. Sources et obtention des cellules

★ À maîtriser

📌 Les cellules en suspension se multiplient dans un milieu liquide sans support d’adhérence, tandis que les cellules adhérentes nécessitent un support pour proliférer.

• Les tissus solides sont dissociés par digestion enzymatique, notamment avec la collagénase ou l’élastase, et par dissociation mécanique des fragments tissulaires.

📌 Une culture primaire dissociée provient directement de cellules isolées d’un tissu, une culture primaire d’explant conserve des amas cellulaires dans de petits fragments tissulaires, et une culture organotypique conserve un morceau de tissu ou un organe.

Compléments

• Les sources de cellules en suspension comprennent:
  • les liquides biologiques
  • le liquide amniotique
  • les ponctions de moelle osseuse
  • les petites tumeurs

💡 Astuce mémo

Suspension dans le liquide, adhérence sur un support

📖 3. Purification et tri cellulaire

★ À maîtriser

• La purification cellulaire vise à obtenir une culture pure constituée d’un seul type cellulaire à partir d’un tissu contenant plusieurs populations.

• La cytométrie couplée à un trieur utilise des anticorps associés à des fluorochromes pour identifier les cellules selon leurs antigènes, puis les sépare après excitation individuelle par un laser.

• Le tri magnétique des lymphocytes B utilise un anticorps anti-CD19 couplé à une bille magnétique, puis un aimant retient les cellules CD19 positives afin de récupérer les lymphocytes B.

Compléments

• Les méthodes physiques comprennent:
  • la centrifugation sur gradient
  • la cytométrie en flux
  • l’ultracentrifugation

💡 Astuce mémo

Gradient, adhérence, immunologie, aimant

📖 4. Mise en culture et entretien

📝 Points essentiels

• 🔄 La culture en suspension suit les étapes suivantes:
  1. récupération de l’échantillon
  2. mise en culture en P0
  3. prolifération jusqu’à la confluence
  4. centrifugation
  5. division et diminution de densité en P1
  6. conservation éventuelle

📌 La congélation cellulaire utilise des cryoprotecteurs comme le glycérol ou le DMSO et un stockage dans l’azote liquide à -196 °C afin de préserver les cellules pendant des années.

• Pour entretenir des cellules adhérentes, on les décolle à la confluence avec de la trypsine, on les centrifuge, puis on les repique à plus faible densité ou on les congèle.

💡 Astuce mémo

P0 → confluence → repiquage ou congélation

📖 5. Dénombrement et viabilité cellulaire

📝 Points essentiels

• 🔄 Le dénombrement manuel consiste à:
  1. décoller les cellules avec de la trypsine
  2. centrifuger les cellules
  3. récupérer le culot
  4. déposer les cellules sur une lame quadrillée
  5. compter les cellules au microscope

📌 Dans un test d’exclusion de colorant, les cellules vivantes ne sont pas colorées car elles expulsent le colorant, tandis que les cellules mortes restent colorées car elles ne peuvent plus l’expulser.

💡 Astuce mémo

Cellule vivante non colorée, cellule morte colorée

📖 6. Cultures primaires et lignées cellulaires

🔑 Notions clés & Définitions

• Lignée cellulaire : Population de cellules homogènes, stables après des mitoses successives et ayant en théorie une capacité illimitée de division grâce à des repiquages successifs.

★ À maîtriser

📌 Les cultures primaires s’épuisent généralement après environ une dizaine de repiquages, tandis que les lignées continues peuvent conserver une capacité de division illimitée.

• Les phases de croissance cellulaire sont:
  • la phase de quiescence ou latence
  • la phase exponentielle
  • la phase stationnaire

Compléments

• Les cellules cancéreuses peuvent être spontanément immortelles, notamment grâce à une forte activité de la télomérase qui empêche le raccourcissement des télomères.

💡 Astuce mémo

Culture primaire limitée, lignée continue potentiellement illimitée

📖 7. Conditions de culture cellulaire

📝 Points essentiels

• Les cellules sont cultivées dans une étuve humide à 37 °C, sous une atmosphère contenant généralement 5 % de CO2 et avec un taux d’humidité d’environ 83 à 84 %.

• Le milieu de culture est maintenu à un pH d’environ 7,4 grâce à des tampons comme l’HEPES et le bicarbonate, avec un taux de CO2 contrôlé entre 5 et 7 %.

• La nutrition cellulaire nécessite: une source de carbone comme le glucose, une source d’azote comme les acides aminés, des facteurs de croissance tels que le sérum de veau, les vitamines, l’insuline et le FGF

📌 La stérilité des cultures est maintenue par une manipulation sous hotte à flux laminaire, l’emploi de milieux et d’instruments stériles et l’utilisation éventuelle d’antibiotiques ou d’antifongiques.

📖 8. Co-cultures et supports tridimensionnels

★ À maîtriser

📌 La co-culture directe place deux types cellulaires dans la même boîte, tandis que la co-culture indirecte les sépare tout en permettant leurs échanges moléculaires.

• Dans une co-culture indirecte par milieu conditionné, le milieu sécrété par un premier type cellulaire est transféré dans la boîte contenant le second type cellulaire afin d’en étudier les effets.

📌 La culture 2D forme généralement une monocouche sur un support, tandis que la culture 3D utilise une matrice ou un gel permettant des interactions cellulaires dans toutes les dimensions et pouvant former des sphéroïdes.

Compléments

• Dans un système d’insert, une membrane poreuse sépare les deux types cellulaires et laisse passer les molécules selon la taille de ses pores.

💡 Astuce mémo

Co-culture directe mélangée, co-culture indirecte séparée

📖 9. Contraintes mécaniques et ingénierie tissulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Bioréacteur : Système qui reproduit des contraintes environnementales, comme un flux, une tension ou une compression, afin de rapprocher la culture cellulaire du milieu d’origine.

📝 Points essentiels

• Les cellules endothéliales soumises à un flux s’alignent dans le sens du flux, deviennent moins perméables et moins inflammatoires, et présentent un stress oxydant diminué.

• En ingénierie tissulaire, on prélève des cellules, on les amplifie dans une matrice adaptée aux conditions d’origine, puis on réimplante le substitut biologique chez l’hôte.

💡 Astuce mémo

Flux ou contrainte mécanique → adaptation cellulaire

📖 10. Organoïdes et analyses cellulaires

🔑 Notions clés & Définitions

• Organoïde : Structure obtenue à partir de cellules isolées, cultivées avec une matrice et des stimulus permettant leur différenciation et la reconstitution partielle d’un organe.

★ À maîtriser

• Les organoïdes servent à étudier les mécanismes des maladies, la toxicologie, le développement, la médecine régénérative, les médicaments et les infections, tout en contribuant au remplacement de l’expérimentation animale.

• Le fractionnement cellulaire homogénéise les cellules en milieu isotonique, les lyse par des moyens mécaniques, physiques, chimiques ou enzymatiques, puis purifie les organites par centrifugation, chromatographie ou électrophorèse.

• La centrifugation différentielle sépare progressivement les constituants cellulaires en augmentant la vitesse et la durée de centrifugation, des noyaux étant récupérés avant les mitochondries, les lysosomes, les microsomes ou l’appareil de Golgi.

• Les tests fonctionnels sur cellules vivantes permettent de suivre la prolifération, la migration, la sénescence, le métabolisme ou la cytotoxicité grâce à l’imagerie et à des sondes spécifiques.

Compléments

• Pour obtenir un organoïde alvéolaire, des cellules épithéliales pulmonaires sont cultivées avec une matrice et des facteurs de croissance et de différenciation, puis s’organisent en un épithélium polarisé après apoptose centrale.

💡 Astuce mémo

Isoler → cultiver → différencier → analyser

📊 Tableaux de synthèse

Types de cultures cellulaires