★ À maîtriser
📌 La microscopie optique utilise des photons et des lentilles en verre, tandis que la microscopie électronique utilise un faisceau d’électrons et des lentilles électromagnétiques.
📌 La réflexion renvoie la lumière dans son milieu d’origine, la réfraction dévie la lumière lorsqu’elle traverse un objet et la diffraction dévie les rayons lorsqu’ils rasent les bords d’un obstacle opaque.
📌 En fond clair, l’échantillon apparaît foncé sur un champ clair, tandis qu’en fond noir il apparaît brillant sur un champ sombre; ces méthodes conviennent aux échantillons vivants non colorés, mais le fond clair offre peu de contraste sans pigmentation ou coloration.
Compléments
Le microscope optique permet notamment l’observation des tissus, cellules, hématies et bactéries.
Le diaphragme règle la quantité de lumière, les molettes règlent la mise au point et la platine porte l’échantillon.
📐 Formule - La distance minimale de résolution vérifie , où est la longueur d’onde et l’ouverture numérique.
Les indices de réfraction indiqués sont n = 1 pour l’air, n = 1,515 pour le verre ordinaire et n = 1,518 pour l’huile à immersion.
Les cellules animales sont incolores et translucides et absorbent la lumière de la même manière que leur arrière-plan.
La microscopie en time-lapse observe en temps réel la dynamique de cellules vivantes dans une enceinte où des paramètres tels que la température, le CO₂, l’O₂ et l’humidité sont contrôlés.
★ À maîtriser
🔄 La préparation comprend les étapes suivantes :
La fixation immobilise les constituants tissulaires et cellulaires dans un état proche de leur état vivant et prévient l’autolyse ainsi que la putréfaction bactérienne post-mortem.
L’inclusion durcit le prélèvement pour permettre sa coupe; la paraffine est liquide entre 52 et 60 °C et se solidifie à température ambiante.
La coloration augmente le contraste et fait apparaître les différents composants cellulaires.
📌 Dans la coloration H&E, l’hématoxyline est basique et colore le noyau en violet ou bleu, tandis que l’éosine est acide et colore le cytoplasme en rose.
📌 L’immunohistochimie utilise une enzyme et un substrat chromogène visibles en lumière blanche, tandis que l’immunofluorescence utilise un fluorochrome visible en lumière fluorescente.
Compléments
La fixation pour la microscopie optique utilise notamment du formaldéhyde à 4 ou 10 %, ou de l’azote liquide à −196 °C.
Les coupes destinées à la microscopie optique mesurent 2 à 5 μm et sont recueillies sur des lames de verre pour laisser passer la lumière.
Les colorations histochimiques illustrées mettent en évidence :
Le montage préserve l’échantillon pour des études ultérieures en appliquant une lamelle sur une lame avec un milieu transparent, chimiquement neutre et d’indice de réfraction proche de celui du verre.
La préparation des échantillons peut entraîner la perte ou l’altération de certains composants cellulaires.
Fixer, inclure, couper, colorer, monter.
★ À maîtriser
En épifluorescence, l’image se forme sur fond noir par détection de la lumière émise par des fluorochromes convenablement excités.
Un fluorophore absorbe la lumière d’excitation puis émet spontanément et instantanément une lumière fluorescente, une partie de l’énergie étant libérée sous forme de chaleur.
📌 La fluorescence primaire est l’émission naturelle de structures biologiques comme les mitochondries et les lysosomes, tandis que la fluorescence secondaire résulte de la liaison d’un fluorochrome aux macromolécules.
En microscopie confocale, un rayon laser focalisé excite les fluorochromes en un point de l’échantillon et le signal émis en ce point, appelé plan focal, est recueilli.
La microscopie confocale élimine le bruit de fond, augmente le contraste et la sensibilité de détection, et permet d’obtenir des coupes optiques XY et XZ ainsi que des reconstructions tridimensionnelles.
Compléments
La protéine fluorescente verte GFP, issue de la méduse Aequorea victoria, émet une fluorescence verte lorsqu’elle est excitée par une lumière bleue.
En couplant une molécule à la fluorescéine et une autre à la rhodamine, leurs répartitions peuvent être suivies dans la même cellule, mais l’épaisseur de l’objet et l’excitation des fluorochromes sur le trajet lumineux produisent un bruit de fond important.
★ À maîtriser
La microscopie électronique utilise un faisceau d’électrons dont la longueur d’onde est plus courte que celle de la lumière blanche, ce qui donne un pouvoir de résolution inférieur à 0,5 nm.
La microscopie électronique peut atteindre un grossissement de 800 000 fois et rendre visibles les organites et les assemblages supramoléculaires.
🔄 La préparation comprend les étapes suivantes :
📌 En microscopie électronique à transmission (MET), les électrons traversent l’échantillon et les régions plus épaisses apparaissent plus sombres; en microscopie électronique à balayage (MEB), les électrons sont diffusés par la surface sans traverser l’échantillon, produisant une image tridimensionnelle avec une grande profondeur de champ.
Compléments
Les coupes pour la microscopie électronique mesurent 60 à 100 nm afin de laisser passer les électrons.
Les métaux lourds cités sont :
MET : les électrons traversent ; MEB : ils diffusent sur la surface.
L’étude morphologique à l’échelle tissulaire et cellulaire considère : l’affinité tinctoriale, la position et l’aspect du noyau, la forme cellulaire, l’organisation entre cellules, les liens avec les autres cellules et la matrice extracellulaire, la cellularité, ou rapport cellules/matrice
L’étude morphologique à l’échelle intracellulaire considère : l’abondance des organites, la présence et l’aspect des vésicules ou granules, la présence d’un nucléole, l’aspect de la chromatine
Les structures des cellules et des tissus sont étroitement liées à leurs fonctions.
★ À maîtriser
📌 Les cellules de type épithélial sont plates ou polygonales, attachées les unes aux autres et entourées de peu de substance intercellulaire, tandis que les cellules de type mésenchymateux sont allongées, fusiformes ou irrégulières et entourées d’une quantité importante de substance intercellulaire.
📌 Les cultures primaires et secondaires contiennent des cellules saines, mortelles et non tumorigènes, tandis que les lignées cellulaires sont immortelles, homogènes et stables après des mitoses successives, avec une capacité théoriquement illimitée de division et une tumorigénicité variable.
Compléments
La culture cellulaire permet d’obtenir un type cellulaire homogène et une grande quantité de cellules, de contrôler l’environnement et les traitements, de disposer d’un modèle proche de la cellule réelle et de minimiser l’utilisation d’animaux de laboratoire.
Chaque type de culture nécessite sa propre formule et la culture cellulaire entraîne une perte des interactions avec le microenvironnement tissulaire, notamment les cellules du stroma, les vaisseaux et les cellules immunitaires.
Les cellules de type lymphoblaste sont sphériques et restent en suspension comme cellules libres et circulantes.
Les cellules de culture primaire sont sensibles à leur environnement et nécessitent un facteur de croissance adapté au type cellulaire ainsi que des boîtes prétraitées avec des protéines matricielles.
La sénescence est un événement génétique qui entraîne une lente dégradation des fonctions de l’organisme.
Le potentiel prolifératif des cellules est inversement proportionnel à leur degré de différenciation.
Les lignées cellulaires peuvent provenir : de cellules cancéreuses, de cellules souches, de cellules saines rendues artificiellement immortelles
La phase de latence dépend :
Le temps de doublement cellulaire varie selon le type cellulaire de 4 à 24 h.
L’épuisement des nutriments peut arrêter la prolifération ou provoquer la mort cellulaire.
Culture primaire et secondaire : cellules mortelles ; lignée : cellules immortelles.
★ À maîtriser
Les sources de cellules libres et circulantes comprennent : le sang périphérique, la moelle osseuse, les liquides physiologiques, notamment les liquides pleuraux
Les cellules en cohésion issues de tissus solides sont obtenues par biopsie ou dissection, puis dissociées mécaniquement par scalpel, broyeur, filtration ou sonication, chimiquement par des chélateurs de Ca++ et Mg++, ou par digestion enzymatique avec de la trypsine ou de la collagénase.
Les populations cellulaires peuvent être séparées par gradient de densité, par adhérence à un support suivie après 24 h de l’élimination des cellules non adhérentes, ou à l’aide de ligands spécifiques comme des anticorps ou des facteurs de croissance.
Compléments
Les cellules libres et circulantes constituent une source relativement pure, accessible et riche en matériel, et peuvent être mises directement en culture.
La dissociation de tissus solides permet d’obtenir une population cellulaire hétérogène.
La culture primaire de kératinocytes suit ces étapes :
Les cultures de kératinocytes peuvent servir à la recherche thérapeutique sur les problèmes de pharmacologie, de toxicologie ou de physiopathologie cutanée.
Prélever, dissocier, séparer, mettre en culture.
★ À maîtriser
La lignée HeLa provient d’une métastase prélevée sans consentement chez une patiente afro-américaine atteinte d’un cancer du col de l’utérus.
La lignée HeLa est la première lignée cellulaire immortelle d’origine humaine jamais établie.
Compléments
Les cellules HeLa ont contribué au développement du premier vaccin antipoliomyélitique, à la fécondation in vitro et à l’étude du SIDA et du cancer.
Les lignées HeLa et HEK293 servent notamment à étudier le trafic intracellulaire, RPE1 et PtK1 la progression du cycle cellulaire, MDCK la polarité, COS-7 l’électroporation et les astrocytes la migration.
L’American Type Culture Collection (ATCC) acquiert, authentifie, produit, conserve, développe et distribue des micro-organismes, des lignées cellulaires et d’autres matériaux pour la recherche en sciences de la vie.
L’ATCC possède une collection de plus de 4 000 lignées cellulaires humaines, animales et végétales.
★ À maîtriser
Le sérum apporte des facteurs mitogènes nécessaires pour déclencher la division cellulaire.
L’incubateur maintient une température de 37 °C, une humidité de 84 à 85 %, un pH de 7,4 grâce aux tampons et à une atmosphère enrichie à 5 % de CO₂, ainsi qu’un apport en O₂.
Compléments
Les ions minéraux du milieu servent notamment de cofacteurs enzymatiques et contribuent à une osmolarité identique à celle du sérum physiologique.
Un indicateur coloré tel que le rouge de phénol permet de visualiser les variations du pH du milieu de culture.
Les compléments ajoutés au milieu peuvent comprendre :
Le sérum de veau fœtal est utilisé à 10 % et apporte des facteurs de croissance, des protéines, des vitamines et des hormones nécessaires à la croissance et à la survie des cellules in vitro.
L’alpha-1-antitrypsine du sérum inhibe la trypsine et neutralise son action enzymatique.
Le sérum doit être décomplémenté par chauffage pendant 30 minutes à 56 °C afin d’inactiver le complément susceptible de détruire les cellules reconnues par des anticorps présents dans le sérum.
Le tampon phosphate salin (PBS) est une solution physiologique de pH 7,4 et d’osmolarité 300 mOsm/L, composée de sels de sodium et de potassium et utilisée comme solvant, solution de rinçage ou diluant.
Les contenants de culture comprennent :
Les pipettes et micropipettes servent à déplacer les suspensions cellulaires et les milieux.
Les tubes et microtubes servent à manipuler les suspensions et les solutés en dehors des flacons.
Une centrifugeuse sépare les constituants d’une préparation en un culot et un surnageant.
Les vortex et les agitateurs servent à mélanger des solutions ; la vitesse de rotation indiquée pour les agitateurs est de 60 à 1 200 tours par minute.
★ À maîtriser
La culture cellulaire peut être réalisée : en suspension liquide pour des cellules non adhérentes, en monocouche pour des cellules adhérentes, en suspension gélifiée d’agar ou de collagène pour des cellules adhérentes en 3D conduisant à la formation de colonies
Le repiquage d’une lignée cellulaire est réalisé entre 80 et 90 % de confluence et impose de travailler en conditions stériles.
🔄 Le repiquage d’une lignée cellulaire consiste à : éliminer le milieu appauvri, rincer au PBS, ajouter la trypsine, inactiver la trypsine avec un milieu complémenté en sérum, centrifuger la suspension, dénombrer les cellules, ensemencer une aliquote dans du milieu neuf
Compléments
La culture en 3D représente mieux les conditions physiologiques du corps que la culture en 2D.
La division cellulaire dure environ 4 à 24 heures.
📌 Le milieu de croissance doit être changé tous les 2 à 3 jours en raison de l’épuisement des nutriments et de l’accumulation de cellules mortes, qui peut acidifier le milieu.
Dans un tapis cellulaire, le contact entre cellules peut inhiber le cycle cellulaire.
Les contaminations cellulaires peuvent être : biologiques, notamment bactériennes, biologiques, notamment fongiques, biologiques, notamment virales, chimiques, notamment dues aux ions métalliques, chimiques, notamment dues aux radicaux libres, chimiques, notamment dues aux résidus de germicides et de pesticides
Une contamination modifie profondément les réactions d’une cellule et peut rendre trouble un milieu de culture normalement limpide.
Le rouge de phénol apparaît rose à pH 7,4, rouge lors d’une alcalinisation associée à une infection fongique et jaune lors d’une acidification associée à une contamination bactérienne.
Le PSM comprend une paillasse en inox, des grilles d’aspiration, un écran transparent, un ventilateur et une zone de filtration qui retient les particules de diamètre supérieur à 0,3 μm.
Pour garantir le fonctionnement du PSM, il faut éviter :
Le travail stérile implique : la désinfection du plan de travail et du matériel à l’alcool à 70 %, le port de gants et de vêtements de protection, la filtration des milieux, la stérilisation des récipients à l’autoclave, le nettoyage des surfaces par rayonnement UV
Détacher, inactiver la trypsine, centrifuger, dénombrer, réensemencer.
★ À maîtriser
La chromatographie liquide sépare les composants d’un mélange en solution, dans la phase mobile, par migration à travers un support solide constituant la phase stationnaire ; leur vitesse dépend de leur affinité respective pour ces phases.
La chromatographie d’affinité purifie une protéine grâce à son interaction biologique avec un ligand spécifique fixé par covalence à une matrice inerte ; la protéine est récupérée en modifiant les conditions d’élution pour la détacher de la matrice.
📌 La chromatographie par filtration sur gel sépare les protéines selon leur masse moléculaire : les petites molécules sont retardées par leur entrée dans les pores, tandis que les grosses molécules en sont exclues et traversent directement la colonne.
📌 L’immunocytochimie et l’immunohistochimie révèlent et ciblent des protéines à l’échelle cellulaire ou tissulaire à l’aide d’un anticorps primaire spécifique associé à une enzyme ou à un fluorochrome.
Compléments
La vitesse de migration des protéines en gel de polyacrylamide dépend de leur taille, de leur forme, de leur densité de charge et du degré de réticulation du gel.
Les tampons alcalins chargent négativement les protéines, qui migrent vers l’anode positive lors de l’électrophorèse en gel de polyacrylamide.
Les marqueurs de poids moléculaire sont un mélange de protéines de poids moléculaires connus servant de références pour estimer le poids moléculaire de la protéine étudiée.
En ELISA, l’intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité d’enzyme présente et donc à la concentration de l’anticorps recherché.
En immunocytochimie ou immunohistochimie avec révélation enzymatique, l’action de l’enzyme sur un substrat chromogène produit un précipité marron observable en lumière blanche au microscope optique.
En immunofluorescence, le DAPI marque le noyau, le GFP les microtubules et le RFP l’appareil de Golgi.
★ À maîtriser
L’analyse des acides nucléiques vise à connaître le contenu informationnel de l’ADN et le niveau d’expression d’un gène dans une condition donnée.
🔄 L’extraction d’ADN ou d’ARN comprend : la lyse mécanique, chimique ou enzymatique des cellules, l’élimination des protéines par le phénol, la concentration de l’ADN et/ou de l’ARN par précipitation à l’alcool, la digestion de l’ADN par la DNase ou de l’ARN par la ribonucléase, l’élution
🔄 Chaque cycle de PCR comprend : la dénaturation de l’ADN bicaténaire à haute température, l’hybridation des deux amorces à l’ADN cible, l’extension de la chaîne par ajout de dNTP grâce à l’ADN polymérase
📌 La PCR classique analyse les produits d’amplification en fin de processus par électrophorèse et fournit un résultat qualitatif de présence ou d’absence de la séquence cible, tandis que la PCR quantitative suit la quantité d’ADN pendant la réaction grâce à une fluorescence proportionnelle à l’accumulation de la séquence cible.
Compléments
Un changement de l’environnement peut se traduire par des changements d’expression de plusieurs dizaines ou plusieurs centaines de gènes.
Les amorces de PCR sont choisies pour encadrer la séquence d’ADN à amplifier et s’hybrident spécifiquement, par complémentarité des bases, à l’un des deux brins d’ADN.
Les composants d’une PCR sont : l’ADN purifié contenant le fragment cible, deux amorces, les dNTP (dATP, dCTP, dGTP et dTTP), une ADN polymérase qui synthétise un nouveau brin à partir du brin matrice après fixation à une amorce
L’automatisation de la PCR repose notamment sur les thermocycleurs, qui modifient rapidement et automatiquement la température, et sur la Taq Polymerase thermostable, qui supporte des températures supérieures à 90 °C pendant les cycles d’amplification.
📌 En hybridation in situ, la FISH utilise une sonde marquée par un fluorochrome et un microscope à fluorescence, tandis que la CISH utilise une sonde marquée par une enzyme et un microscope à fond clair.
Lyser, éliminer les protéines, précipiter, digérer les acides nucléiques indésirables, éluer.
★ À maîtriser
L’incorporation du BrdU, analogue synthétique de la thymidine, permet de quantifier la réplication de l’ADN car le BrdU s’incorpore exclusivement pendant la phase S.
La mesure de l’activité mitochondriale par la luciférase quantifie l’ATP intracellulaire : en présence de luciférine et d’ATP, la réaction produit une lumière mesurée au luminomètre, dont le signal est proportionnel au nombre de cellules vivantes.
Le test MTT mesure l’activité de la succinate déshydrogénase mitochondriale, qui couple une réaction d’oxydation à la réduction du MTT jaune en formazan violet ; le signal est proportionnel au nombre de cellules vivantes.
Compléments
🔄 La mesure de l’incorporation du BrdU comprend : une incubation en présence de BrdU, l’ajout d’un anticorps primaire anti-BrdU puis d’un anticorps secondaire, la mesure du BrdU incorporé
La mort cellulaire peut être détectée par le bourgeonnement de la membrane plasmique observé en microscopie photonique.
L’ADN des cellules apoptotiques apparaît sous forme de petits fragments en échelle après électrophorèse sur gel d’agarose, alors que l’ADN des cellules saines forme une seule bande.
La technique TUNEL détecte les fragments d’ADN libres en marquant leurs extrémités par fluorescence.
Le bleu trypan ne pénètre que dans les cellules dont la membrane plasmique est endommagée et permet ainsi de détecter la mort cellulaire.
Le dosage de la lactate déshydrogénase (LDH) détecte le passage de marqueurs cytoplasmiques vers le milieu de culture lorsque les cellules ont perdu leur intégrité membranaire.
Le test de blessure consiste à arracher une bande de cellules d’une monocouche, par exemple avec une pointe de pipette, puis à suivre la migration cellulaire par vidéomicroscopie en accéléré.
BrdU suit la réplication ; ATP et MTT renseignent sur la viabilité.
★ À maîtriser
L’analyse d’image permet de décrire, mesurer et comparer les prélèvements biologiques de façon précise, objective et reproductible, et de corréler ces résultats aux données biochimiques et cliniques.
Un programme d’analyse d’images comprend : l’acquisition de l’image numérique, la sélection des zones d’intérêt, la mesure du dénombrement, de la taille, de la forme, de l’intensité et de la répartition spatiale
Compléments
L’acquisition numérique décompose une image en pixels auxquels sont associées une ou plusieurs valeurs numériques décrivant leur couleur et leur intensité.
Les logiciels ImageJ et Fiji peuvent être utilisés pour l’analyse d’images, de la version de base à la version programmée.
Acquérir, sélectionner, mesurer.
| Microscope | Signal observé | Image ou caractéristique |
|---|---|---|
| Fond clair | Lumière transmise | Échantillon foncé sur champ clair |
| Fond noir | Lumière réfléchie par l’échantillon | Échantillon brillant sur champ sombre |
| MET | Électrons traversant l’échantillon | Les régions épaisses apparaissent sombres |
| MEB | Électrons diffusés par la surface | Image 3D de surface, grande profondeur de champ |
| Méthode | Cible ou principe | Lecture |
|---|---|---|
| Western blot | Protéine reconnue par un anticorps spécifique | Identification de la protéine |
| ELISA | Interaction antigène-anticorps et réaction enzymatique | Coloration proportionnelle à la concentration recherchée |
| ICC/IHC enzymatique | Anticorps spécifique et substrat chromogène | Précipité marron en lumière blanche |
| Immunofluorescence | Anticorps associé à un fluorochrome | Signal observé en fluorescence |
Teste tes connaissances sur Culture cellulaire et méthodes d’analyse avec 50 questions à choix multiples et corrections détaillées.
1. Pour observer une cellule avec un microscope optique plutôt qu’un microscope électronique, quelle combinaison caractérise l’instrument optique ?
2. Dans un montage d’optique, un rayon lumineux est dévié lorsqu’il traverse un échantillon transparent. Quel phénomène observe-t-on ?
Mémorisez les concepts clés de Culture cellulaire et méthodes d’analyse avec 93 flashcards interactives.
Quelles sources et lentilles distinguent les microscopes optique et électronique ?
L’optique utilise des photons et des lentilles en verre ; l’électronique, des électrons et des lentilles électromagnétiques.
Quel est le rôle de l’objectif dans un microscope optique ?
Il agrandit l’objet.
Que fait la lumière lors d’une réflexion ?
Elle est renvoyée dans son milieu d’origine.
Importe ton cours et l'IA génère fiches, QCM et flashcards en 30 secondes.
Générateur de fiches