Fiche de révision : Culture cellulaire

📋 Plan du Cours

1. Intérêts et définition de la culture
2. Sources et isolement des cellules
3. Entretien et viabilité cellulaire
4. Cultures primaires et lignées
5. Conditions de culture et modèles
6. Ingénierie tissulaire et organoïdes
7. Analyses et fractionnement cellulaire
8. Tests fonctionnels sur cellules vivantes

📖 1. Intérêts et définition de la culture

🔑 Notions clés & Définitions

• Culture cellulaire : Ensemble des techniques permettant de faire croître des cellules hors de l’organisme ou de leur milieu d’origine, pour l’expérimentation scientifique, le diagnostic ou un but médical.

★ À maîtriser

• La recherche fondamentale étudie notamment:

  • le cycle cellulaire
  • les tests fonctionnels
  • l’expression des gènes
  • le métabolisme

• Les applications médicales comprennent:

  • les greffes
  • l’ingénierie cellulaire et tissulaire
  • le dépistage de maladies génétiques
  • les études chromosomiques
  • la thérapie génique ou cellulaire
  • la fécondation in vitro

Compléments

• L’industrie pharmaceutique utilise la culture cellulaire pour les études toxicologiques et pharmacologiques de nouvelles molécules, ainsi que pour produire des hormones de croissance, des cytokines, des anticorps et des vaccins.

📖 2. Sources et isolement des cellules

★ À maîtriser

📌 Les cellules peuvent être adhérentes, lorsqu’elles se développent fixées à un support, ou en suspension, lorsqu’elles se multiplient dans le milieu liquide.

• L’isolement des cellules mononucléées du sang repose sur une prise de sang suivie d’une centrifugation sur gradient de densité de Ficoll.

• Les PBMC comprennent environ:

  • 15 % de lymphocytes B
  • 70 % de lymphocytes T
  • 5 % de monocytes
  • 10 % de cellules natural killer

• Les méthodes de purification comprennent:

  • le gradient de densité
  • la cytométrie en flux
  • l’ultracentrifugation
  • le tri par avantage prolifératif
  • le tri par adhérence
  • la méthode immunologique

Compléments

• Les cellules en suspension peuvent provenir du sang, de la moelle ou de liquides biologiques, et certains types de cellules tumorales à petites cellules se multiplient également en suspension.

• L’isolement des cellules issues d’un tissu solide repose notamment sur une dissociation mécanique ou enzymatique utilisant la collagénase ou l’élastase.

💡 Astuce mémo

Prélever → dissocier → trier → cultiver

📖 3. Entretien et viabilité cellulaire

★ À maîtriser

• 🔄 L’entretien des cellules en suspension suit:

  1. l’ensemencement
  2. la croissance
  3. la centrifugation
  4. le repiquage

• 🔄 L’entretien des cellules adhérentes suit:

  1. l’ensemencement
  2. la croissance jusqu’à la confluence
  3. la trypsination
  4. la centrifugation
  5. le passage vers P1

📌 La congélation cellulaire à l’azote liquide, à -196 °C, nécessite des cryoprotecteurs comme le glycérol ou le DMSO pour congeler les cellules sans altérer leurs structures.

• Le test d’exclusion d’un colorant évalue la viabilité cellulaire en distinguant les cellules qui expulsent le colorant de celles qui le laissent traverser leur membrane.

Compléments

• Les colorants vitaux comprennent:
  • l’éosine
  • l’iodure de propidium
  • le bleu Trypan

💡 Astuce mémo

Ensemencer → croître → centrifuger ou trypsiner → repiquer

📖 4. Cultures primaires et lignées

🔑 Notions clés & Définitions

• Lignée cellulaire : Population homogène de cellules, stable après des mitoses successives et théoriquement capable de se diviser indéfiniment par repiquages successifs in vitro.

★ À maîtriser

📌 Une culture primaire est obtenue directement à partir d’un tissu ou d’un liquide biologique, tandis qu’une culture secondaire provient du repiquage d’une culture primaire.

📌 Une lignée cellulaire peut avoir une durée de vie limitée par dégénérescence ou vieillissement, ou une durée de vie illimitée lorsqu’il s’agit d’une lignée continue.

Compléments

• Les cellules cancéreuses peuvent être spontanément immortelles, notamment grâce à une forte activité télomérase, tandis que des cellules saines peuvent être immortalisées par transformation mutagène chimique, physique ou par des virus oncogènes comme le virus T de SV40.

💡 Astuce mémo

Primaire : durée limitée ; lignée continue : divisions prolongées

📖 5. Conditions de culture et modèles

★ À maîtriser

📌 La culture cellulaire se réalise généralement dans une étuve humide à 37 °C, avec une humidité de 83 à 84 %, afin d’éviter l’évaporation et l’augmentation de l’osmolarité.

📌 Le pH de culture est proche de 7,4 ou du pH du milieu d’origine et est contrôlé par des tampons comme l’HEPES ou les bicarbonates, avec une atmosphère enrichie à 5 à 7 % de CO2.

• Les conditions nutritives fournissent une source de carbone comme le glucose, une source d’azote comme les acides aminés et des facteurs de croissance provenant notamment du sérum de veau et des vitamines.

• La stérilité repose sur:

  • la manipulation sous hotte
  • les milieux stériles
  • les instruments stériles
  • la pénicilline
  • la streptomycine
  • les antifongiques

📌 Une co-culture directe met les cellules en contact, tandis qu’une co-culture indirecte permet une interaction continue sans mélange direct, notamment grâce à un insert ou à un milieu conditionné.

Compléments

• Les protéines de la matrice extracellulaire améliorent l’adhésion, la prolifération et la différenciation cellulaires dans les supports de culture 2D ou 3D.

💡 Astuce mémo

Milieu contrôlé → survie, prolifération et différenciation cellulaires

📖 6. Ingénierie tissulaire et organoïdes

🔑 Notions clés & Définitions

• Bioréacteur : Système permettant de maintenir les contraintes environnementales appliquées aux cellules, notamment la tension, la compression ou un débit dynamique pulsatile.

• Organoïde : Un organoïde est un modèle cellulaire tridimensionnel dont le développement peut être obtenu à partir de cellules épithéliales et de facteurs de croissance et de différenciation, comme dans les tumoroïdes.

★ À maîtriser

• 🔄 La mécanotransduction entraîne: l’activation de voies de signalisation cellulaire, la modulation de l’expression des gènes, l’adaptation du comportement cellulaire

• L’ingénierie tissulaire vise à développer des substituts biologiques capables de restaurer, maintenir ou améliorer la fonction des tissus et à limiter l’expérimentation animale selon le principe des 3R, notamment le remplacement.

Compléments

• Sous flux laminaire, les cellules endothéliales s’alignent et présentent un turnover lent, une faible perméabilité, l’expression de gènes anti-inflammatoires et une minimisation du stress oxydant.

💡 Astuce mémo

Contraintes environnementales contrôlées → tissus et substituts biologiques fonctionnels

📖 7. Analyses et fractionnement cellulaire

★ À maîtriser

• Les analyses de cellules lysées comprennent:
  • le fractionnement des organites
  • le Western blot
  • la RT-PCR quantitative

• 🔄 Le fractionnement comprend: l’homogénéisation en milieu isotonique, la purification, la centrifugation différentielle ou sur gradient de densité

Compléments

• Les analyses de cellules fixées comprennent:

  • le marquage
  • la coloration
  • l’immunocytochimie ou fluorescence
  • l’hybridation in situ
  • la cytométrie

• Les méthodes d’homogénéisation sont:

  • l’écrasement mécanique
  • les ultrasons ou la haute pression
  • les détergents ou les enzymes

💡 Astuce mémo

Lyser ou fixer → fractionner ou marquer → analyser

📖 8. Tests fonctionnels sur cellules vivantes

★ À maîtriser

• Les fonctions étudiées comprennent:

  • la prolifération
  • la cytotoxicité
  • la migration
  • la sénescence
  • le métabolisme
  • le stress oxydatif

• Le couplage de l’imagerie en contraste de phase et de la fluorescence permet de suivre en temps réel des paramètres fonctionnels cellulaires.

Compléments

• Les modèles d’étude de la migration comprennent:
  • la blessure ou cicatrisation
  • la chambre de Boyden
  • le test de la zone d’exclusion

• Les paramètres métaboliques de cellules vivantes peuvent être mesurés avec deux fluorophores, des fibres optiques et des cellules ou mitochondries, notamment en présence d’inhibiteurs de la chaîne respiratoire mitochondriale.

📊 Tableaux de synthèse

Principaux types de cultures

Analyses selon l’état cellulaire