Fiche de révision : Dénombrement et concentration cellulaire

📋 Plan du Cours

1. Numération en cellule de Malassez
2. Turbidimétrie et étalonnage
3. Filtration sur membrane
4. Méthode du nombre probable
5. Dénombrement sur milieu solide
6. Contrôle microbiologique du lait
7. Plans d’échantillonnage microbiologique
8. Cytométrie en flux

📖 1. Numération en cellule de Malassez

📝 Points essentiels

• 🔄 La numération suit plusieurs étapes:
  1. Humidifier les plates-formes latérales
  2. Faire adhérer la lamelle
  3. Remplir la chambre avec l’échantillon homogénéisé
  4. Attendre 1 minute pour la sédimentation
  5. Compter au microscope à l’objectif ×40

📌 Lors du comptage, toutes les cellules du rectangle ainsi que celles qui chevauchent le bord haut et le bord droit sont comptées.

📐 Formule — La concentration cellulaire s’obtient par $C_N = \frac{N_{cellules}}{V_{comptage}\times d}$, où d représente la dilution éventuelle de l’échantillon.

• Le bleu de méthylène permet de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes : les cellules vivantes dégradent ou expulsent le colorant, tandis que les cellules mortes restent colorées.

💡 Astuce mémo

Diluer → remplir → sédimenter → compter

📖 2. Turbidimétrie et étalonnage

🔑 Notions clés & Définitions

• Turbidimétrie : Mesure l’atténuance d’une culture au spectrophotomètre afin d’estimer indirectement sa concentration bactérienne.

📝 Points essentiels

📌 Pour Pseudomonas aeruginosa, la relation d’étalonnage utilisée est de 8,0 × 10^7 bactéries·mL^-1 pour 0,1 unité d’atténuance et elle n’est linéaire qu’entre 0,1 et 0,8.

📐 Formule — Une atténuance de 0,6 correspond à une concentration de $4{,}8 \times 10^8\ \text{bactéries·mL}^{-1}$.

📌 Une atténuance directe de 1,4 ne peut pas être utilisée pour calculer la concentration, car elle dépasse la limite de linéarité et correspond à une saturation de l’appareil.

📐 Formule — Après une dilution au 1/5, une atténuance de 0,350 correspond à $2{,}8 \times 10^8\ \text{bactéries·mL}^{-1}$ dans l’échantillon dilué et à $1{,}4 \times 10^9\ \text{bactéries·mL}^{-1}$ dans le bioréacteur.

💡 Astuce mémo

0,1–0,8 : linéaire ; au-delà de 0,8 : saturation

📖 3. Filtration sur membrane

📝 Points essentiels

• La filtration sur membrane consiste à filtrer 250 mL d’eau sur une membrane stérile de porosité 0,45 µm, puis à déposer cette membrane sur une gélose sélective et à compter les colonies après incubation.

📌 Les bactéries restent bloquées sur la membrane parce que ses pores de 0,45 µm retiennent les cellules bactériennes.

📐 Formule — Trois colonies obtenues après filtration de 250 mL correspondent à $1{,}2\ \text{UFC}/100\ \text{mL}$.

📌 L’eau n’est pas conforme à l’exigence de 0 coliforme pour 100 mL, car la filtration a révélé 1,2 UFC de coliformes pour 100 mL.

💡 Astuce mémo

Faible contamination → concentration sur membrane → détection des colonies

📖 4. Méthode du nombre probable

🔑 Notions clés & Définitions

• Tube positif : Positif lorsque l’on observe simultanément un trouble microbien et une bulle de gaz occupant au moins 1/10e de la cloche de Durham.

📝 Points essentiels

• Dans le milieu BLBVB, la bile de bœuf et le vert brillant inhibent les bactéries Gram positives, tandis que le lactose est le sucre fermenté par les coliformes.

• 🔄 La méthode du NPP suit plusieurs étapes:

  1. Préparer les dilutions 10^-1 à 10^-5
  2. Ensemencer trois tubes par dilution avec 1 mL
  3. Incuber 48 heures à 44 °C
  4. Observer le trouble et le gaz
  5. Interpréter les tubes positifs

💡 Astuce mémo

Trouble seul ≠ tube positif ; trouble + gaz = positif

📖 5. Dénombrement sur milieu solide

📝 Points essentiels

• Le dénombrement sur milieu solide consiste à réaliser des dilutions décimales, ensemencer 0,1 mL sur gélose nutritive, incuber 24 heures à 37 °C puis compter les UFC.

📌 Il faut retenir deux dilutions successives dont l’une au moins donne entre 10 et 300 colonies par boîte.

📐 Formule — La concentration est calculée par $N = \frac{\Sigma C}{V \times 1{,}1 \times d}$, où ΣC est la somme des colonies, V le volume inoculé et d la dilution la moins diluée retenue.

💡 Astuce mémo

Diluer → ensemencer → incuber → compter → calculer

📖 6. Contrôle microbiologique du lait

📝 Points essentiels

📌 La flore aérobie mésophile totale du lait pasteurisé ne doit pas dépasser 3,0 × 10^4 UFC·mL^-1 au moment de l’emballage.

📐 Formule — Avec les boîtes 10^-3 et 10^-4, la concentration du lait est $N = \frac{195+18}{0{,}1\times1{,}1\times10^{-3}} \approx 1{,}9\times10^6\ \text{UFC·mL}^{-1}$.

📌 Le lot de lait doit être rejeté, car sa concentration estimée de 1,9 × 10^6 UFC·mL^-1 dépasse le seuil réglementaire de 3,0 × 10^4 UFC·mL^-1.

📌 La cellule de Malassez compte directement les cellules mortes et vivantes, tandis que le dénombrement sur milieu solide compte les microorganismes vivants capables de former des colonies.

💡 Astuce mémo

Malassez compte morts et vivants ; la culture compte seulement les vivants

📖 7. Plans d’échantillonnage microbiologique

📝 Points essentiels

📌 Un plan d’échantillonnage à 2 classes donne un résultat binaire : le lot est satisfaisant si aucune bactérie n’est détectée et il est rejeté dès qu’une bactérie est détectée dans l’un des échantillons.

📌 Un plan d’échantillonnage à 3 classes distingue une zone satisfaisante lorsque le résultat est inférieur ou égal à m, une zone acceptable entre m et M et une zone insatisfaisante au-delà de M, avec M = 10 × m.

• Pour les rillettes, le plan impose n = 5 échantillons, c = 2 résultats autorisés entre m et M, m = 10 UFC·g^-1 et M = 100 UFC·g^-1.

📌 Le lot de 5 000 pots de rillettes est rejeté, car un seul échantillon dépasse M = 100 UFC·g^-1, même si le nombre de résultats compris entre m et M ne dépasse pas c.

💡 Astuce mémo

Deux classes : présence/absence ; trois classes : m, M et c

📖 8. Cytométrie en flux

📝 Points essentiels

• En cytométrie en flux, les microorganismes circulent un par un dans un flux liquide devant un laser, qui fournit des informations de taille, de structure et de fluorescence.

📌 Un double marquage fluorescent permet de distinguer les bactéries vivantes actives, marquées par un colorant entrant dans les cellules à membrane intacte, des bactéries mortes, marquées par un colorant pénétrant les membranes endommagées.

💡 Astuce mémo

Des cellules défilent une par une devant un laser

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des techniques de dénombrement