Fiche de révision : Méthodes de chromatographie quantitative

📋 Plan du Cours

1. Principes de la quantification chromatographique
2. Étalonnage externe
3. Étalonnage interne
4. Normalisation interne
5. Méthode des ajouts dosés
6. Principes de la CLHP
7. Propriétés des analytes
8. Détection et dérivation des analytes

📖 1. Principes de la quantification chromatographique

★ À maîtriser

• En chromatographie, la surface ou la hauteur d’un pic est liée à la quantité de soluté ayant traversé le détecteur.

📐 Formule - La relation quantitative entre la masse analysée et l’aire du pic s’écrit $M_i = K_i \times A_i$, où $M_i$ est la masse, $K_i$ le coefficient de réponse et $A_i$ l’aire du pic.

Compléments

• Plus le coefficient de réponse est grand, plus la méthode quantitative est sensible.

• Les détecteurs différentiels mesurent la variation de grandeurs proportionnelles à la concentration du soluté dans l’effluent.

📖 2. Étalonnage externe

★ À maîtriser

• L’étalonnage externe compare les aires obtenues pour une référence de concentration connue et un échantillon, injectés au même volume et dans les mêmes conditions d’analyse.

• Une référence unique convient si sa concentration est proche de celle de l’échantillon ; sinon, une gamme étalon permet d’établir la relation entre concentration et aire.

📌 La droite d’étalonnage ne doit passer par zéro que si cette propriété a été vérifiée statistiquement et si le domaine de linéarité est établi.

Compléments

• Avec une référence unique et une réponse proportionnelle, la concentration de l’échantillon se déduit par proportionnalité entre concentration et aire du pic.

• Une gamme étalon comporte au moins 5 points, conformément à l’ICH.

📖 3. Étalonnage interne

🔑 Notions clés & Définitions

• Étalonnage interne : L’étalonnage interne utilise le coefficient de réponse relatif de chaque analyte par rapport à un marqueur ajouté comme référence.

★ À maîtriser

• L’étalon interne doit avoir une pureté connue, être chimiquement inerte et ne pas être présent comme impureté dans l’échantillon.

• L’étalon interne doit avoir un temps de rétention distinct de ceux des constituants de l’échantillon et être séparé de l’analyte.

• L’étalonnage interne compense les imprécisions du volume injecté en chromatographie en phase gazeuse et certaines pertes ou variations dues aux manipulations préalables, comme la dilution ou l’extraction.

Compléments

• Le coefficient de réponse de l’étalon interne doit être du même ordre que celui de l’analyte, et sa concentration doit être proche de celle de l’analyte.

• En étalonnage interne, la quantification repose sur le rapport des signaux de l’analyte et de l’étalon interne.

📖 4. Normalisation interne

🔑 Notions clés & Définitions

• Normalisation interne : La normalisation interne quantifie un constituant comme une fraction du signal total d’un mélange dont tous les constituants sont identifiés et élués.

★ À maîtriser

📌 La normalisation interne exige que les constituants aient des coefficients de réponse voisins ou identiques pour que leurs proportions de surface représentent leurs proportions dans le mélange.

Compléments

• La normalisation interne est notamment applicable avec un réfractomètre en CLHP ou un détecteur à ionisation de flamme en CPG, lorsque les coefficients de réponse sont voisins.

📌 En UV-visible, la normalisation interne est possible seulement si tous les constituants possèdent un chromophore et le même coefficient d’absorption molaire ε.

📖 5. Méthode des ajouts dosés

🔑 Notions clés & Définitions

• Ajouts dosés : La méthode des ajouts dosés quantifie un analyte en ajoutant à l’échantillon des quantités connues d’analyte pur.

★ À maîtriser

• Pour déterminer la quantité initiale d’analyte, on mesure le signal de l’échantillon, on ajoute une quantité connue d’analyte pur, puis on mesure l’augmentation du signal.

• Les ajouts dosés permettent de limiter les effets de matrice en préparant l’étalonnage dans la matrice même de l’échantillon.

Compléments

📌 Deux droites d’étalonnage parallèles, l’une externe et l’autre obtenue par ajouts dans la matrice, indiquent l’absence d’interférences de matrice.

• Une gamme d’ajouts dosés peut être construite avec 4 à 6 ajouts.

📖 6. Principes de la CLHP

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie liquide haute performance : La chromatographie liquide haute performance est une méthode de séparation fondée sur la distribution différente des espèces entre une phase stationnaire et une phase mobile non miscibles.

★ À maîtriser

• La CLHP est largement utilisée dans le domaine du médicament pour déterminer la teneur en substance active et en impuretés.

• La rétention et la sélectivité dépendent de :

  • les propriétés du soluté
  • la nature de la phase stationnaire
  • la composition de la phase mobile
  • la température

Compléments

📌 La sélectivité décrit la capacité du système chromatographique à séparer des molécules de structures proches.

• Le cours distingue les petites molécules de masse moléculaire inférieure à 2000 et les grosses molécules, notamment protéines et peptides, de masse moléculaire supérieure à 2000.

📖 7. Propriétés des analytes

★ À maîtriser

• Les composés polaires sont solubles dans l’eau, les composés apolaires dans l’hexane ou le dichlorométhane, et les composés de polarité intermédiaire dans le 2-propanol.

• En chromatographie, un composé polaire est retenu sur une phase stationnaire polaire, tandis qu’un composé apolaire est retenu sur une phase stationnaire apolaire.

• L’état d’ionisation d’un groupement dépend du pH et du pKa, et la rétention peut donc changer selon la forme moléculaire ou ionisée de l’analyte.

Compléments

• Les groupements fonctionnels ionisables ont un caractère acido-basique et peuvent être fortement ou faiblement ionisés selon le transfert du proton.

• Pour un acide carboxylique de pKa 5, le groupement est sous forme COOH à pH 2 et sous forme COO− à pH 7.

💡 Astuce mémo

Polaire avec polaire, apolaire avec apolaire : la rétention suit l’affinité.

📖 8. Détection et dérivation des analytes

🔑 Notions clés & Définitions

• Dérivation : La dérivation modifie la structure d’un analyte dépourvu de groupement détectable en y incorporant un groupe d’atomes adapté au mode de détection.

★ À maîtriser

• Les chromophores sont des motifs absorbant en UV-visible, les fluorophores sont des molécules fluorescentes et les électrophores sont des composés détectables par oxydation ou réduction.

Compléments

• La fluorescence est influencée par :

  • le pH
  • la température
  • la polarité du solvant
  • une éventuelle photodécomposition

• Les composés organiques électroactifs cités sont : les phénols, notamment hydroquinones et catéchols, les amines aromatiques, les thiols, les quinones, les composés nitrés, les sucres de type aminosides

• La dérivation nécessite un groupement fonctionnel réactif, par exemple un carboxyle, une amine primaire ou un thiol.

📌 La dérivation précolonne convient à une réaction lente, tandis qu’une réaction rapide peut être réalisée en postcolonne, comme avec l’OPA.

• Dans l’exemple du cours, l’OPA ajoute des cycles insaturés aux amines de la tobramycine afin de rendre celle-ci détectable en UV.

• En chromatographie gazeuse, la dérivation des sucres peut les rendre volatils, et toute dérivation doit avoir lieu avant la détection.