Fiche de révision : Méthodes d’étude en biologie cellulaire

📋 Plan du Cours

1. Recherche biomédicale et modèles d’étude
2. Culture primaire et digestion tissulaire
3. Purification des cellules
4. Cellules primaires et milieux de culture
5. Conditions et limites des cultures
6. Lignées immortalisées et transformées
7. Anticorps et immunodétection
8. Cytométrie en flux et tri cellulaire
9. Modification de l’expression génique
10. Protéines de fusion et microscopie
11. Applications biomédicales
12. SynthesisTables

📖 1. Recherche biomédicale et modèles d’étude

🔑 Notions clés & Définitions

• Biologie cellulaire : Étude des mécanismes intracellulaires nécessaires au bon fonctionnement de la cellule.
• Recherche biomédicale : Vise à améliorer la santé humaine par une démarche expérimentale et à identifier les mécanismes cellulaires et leurs causes impliqués dans les pathologies.

★ À maîtriser

• Les fonctions cellulaires sont principalement assurées par des protéines, ce qui conduit la recherche biomédicale à étudier les protéines, les gènes qui les codent, les organites pathologiques et les effets pharmacologiques.

Compléments

• Le nématode Caenorhabditis elegans possède 13 000 gènes et toujours 959 cellules et sert notamment à étudier l’apoptose.

• La mouche Drosophila melanogaster possède un génome dont plus de la moitié est proche de celui de l’humain et sert notamment à étudier génétiquement la maladie d’Alzheimer.

• La souris Mus musculus peut être génétiquement modifiée, notamment sous la forme de souris KO, tandis que le cochon sert à des études chirurgicales, notamment bariatriques, en raison de sa proximité anatomique avec l’Homme.

💡 Astuce mémo

Dysfonctionnement cellulaire → pathologie → recherche de mécanismes et traitements

📖 2. Culture primaire et digestion tissulaire

★ À maîtriser

• 🔄 La primo-culture comprend les étapes suivantes:

  1. Prélèvement d’un explant, d’une biopsie ou d’un organe entier
  2. Digestion de la matrice extracellulaire
  3. Obtention d’une suspension de différents types cellulaires
  4. Purification pour isoler un seul type cellulaire

• La trypsine et la collagénase sont des enzymes protéolytiques utilisées pour dégrader les constituants protéiques, notamment le collagène, de la matrice extracellulaire.

• Les chélateurs de cations divalents capturent notamment le calcium Ca²⁺, dont la présence est nécessaire aux interactions entre les cellules et leur matrice extracellulaire.

Compléments

• La hyaluronidase dégrade l’acide hyaluronique de la matrice extracellulaire.

📌 L’EDTA capture le calcium et le magnésium et peut aussi servir d’anticoagulant, tandis que l’EGTA est un chélateur du calcium.

💡 Astuce mémo

Prélèvement → digestion → suspension → purification

📖 3. Purification des cellules

🔑 Notions clés & Définitions

• Adhérence différentielle : Sépare les types cellulaires selon leur vitesse d’adhérence au support.

★ À maîtriser

• La centrifugation sépare les types cellulaires selon leur vitesse de sédimentation, qui dépend de leur densité propre.

• Dans un gradient de Ficoll, on observe:

  • Le plasma au-dessus du gradient
  • Les cellules mononucléées à la surface du gradient
  • Les globules rouges au fond du tube

Compléments

• Dans le sang, les macrophages adhèrent au support tandis que les lymphocytes n’y adhèrent pas, ce qui permet de les séparer après dépôt, attente et rinçages.

• Dans le tissu musculaire, les fibroblastes adhèrent plus rapidement au fond d’une boîte recouverte de collagène, tandis que les cellules satellites restent dans le surnageant.

💡 Astuce mémo

Centrifugation = densité ; adhérence = vitesse d’adhérence

📖 4. Cellules primaires et milieux de culture

🔑 Notions clés & Définitions

• Milieu défini : Contient des facteurs de croissance dont la composition et la concentration sont connues.

★ À maîtriser

📌 Les cellules très différenciées, comme les cardiomyocytes, sont incapables de proliférer, tandis que les cellules peu ou pas différenciées peuvent proliférer dans une certaine mesure.

• 🔄 Le repiquage comprend les étapes suivantes:
  1. Détacher les cellules avec de l’EDTA et de la trypsine
  2. Diluer les cellules
  3. Les ensemencer dans un nouveau support
  4. Reprendre la prolifération dans une culture secondaire

Compléments

• Le sérum de veau fœtal apporte en grand nombre des facteurs de croissance de composition et de concentration inconnues et est utilisé à 10 % v/v.

• Un milieu de culture contient principalement:

  • De l’eau
  • Du glucose, des acides aminés et des ions
  • Du rouge de phénol
  • Des facteurs de croissance
  • Des antibiotiques
  • Des vitamines et de l’insuline

💡 Astuce mémo

Très différenciées = peu prolifératives ; peu différenciées = amplifiables

📖 5. Conditions et limites des cultures

🔑 Notions clés & Définitions

• Sénescence réplicative : Arrêt de la prolifération lié au raccourcissement des télomères après environ 30 à 50 passages.

★ À maîtriser

• Le milieu de culture assure:

  • La survie cellulaire
  • La prolifération cellulaire
  • La stimulation de la différenciation cellulaire

• Les cellules adhérentes sont cultivées sur des boîtes en plastique ou en verre, éventuellement recouvertes de collagène, de laminine ou de fibronectine, tandis que les lymphocytes poussent en suspension.

• L’incubateur est généralement thermostaté à 37 °C, maintenu humide et réglé à 5 % de CO₂ pour conserver l’équilibre acido-basique et le pH du milieu.

Compléments

• Un poste de sécurité microbiologique de type 2 équipé d’un filtre HEPA fournit un air dépourvu de microorganismes et maintient la stérilité de la culture.

• Les fibroblastes issus d’une biopsie cutanée peuvent effectuer environ 30 passages chez un patient de 70 à 80 ans et environ 40 passages chez un patient de 40 à 50 ans.

💡 Astuce mémo

Télomères raccourcis → sénescence réplicative → arrêt de prolifération

📖 6. Lignées immortalisées et transformées

🔑 Notions clés & Définitions

• Lignée immortalisée : Maintient ses capacités de prolifération grâce notamment à l’apport du gène codant la télomérase, qui rallonge les télomères et lève la sénescence réplicative.
• Lignée transformée : Lignée cancéreuse qui prolifère indéfiniment sans sénescence réplicative et peut proliférer à confluence en multicouches.

★ À maîtriser

• Une lignée immortalisée:
  • Croît en monocouche
  • Présente une inhibition de contact
  • Peut modifier l’expression de certains gènes
  • Peut être congelée dans l’azote liquide

📌 La transformation cellulaire peut résulter de l’activation constitutive des oncogènes ou de l’inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs, et une mutation de p53 fait perdre les points de contrôle de la division cellulaire.

Compléments

• Les cellules HeLa sont une lignée cellulaire cancéreuse provenant de métastases d’un cancer du col de l’utérus.

💡 Astuce mémo

Immortalisée : inhibition de contact ; transformée : prolifération à confluence

📖 7. Anticorps et immunodétection

🔑 Notions clés & Définitions

• Anticorps : Immunoglobuline produite par un plasmocyte, c’est-à-dire un lymphocyte B différencié, et dirigée contre un antigène.

★ À maîtriser

• Un anticorps possède deux chaînes légères, deux chaînes lourdes et une région variable correspondant au paratope, qui reconnaît l’épitope de l’antigène.

📌 Les anticorps polyclonaux proviennent de différents clones de lymphocytes B et reconnaissent plusieurs épitopes d’un même antigène, tandis qu’un anticorps monoclonal provient d’un seul clone et reconnaît un seul épitope.

📌 L’immunodétection directe utilise un anticorps primaire directement couplé à un rapporteur, tandis que l’immunodétection indirecte utilise un anticorps primaire non marqué et un anticorps secondaire porteur du rapporteur.

Compléments

📌 Un anticorps séquentiel reconnaît une succession d’acides aminés de la structure primaire, tandis qu’un anticorps conformationnel reconnaît des régions éloignées dans la structure primaire mais rapprochées dans la structure tertiaire.

• En immunofluorescence, Texas Red émet dans le rouge et FITC émet dans le vert.

💡 Astuce mémo

Polyclonal = plusieurs clones et épitopes ; monoclonal = un clone et un épitope

📖 8. Cytométrie en flux et tri cellulaire

★ À maîtriser

• La cytométrie en flux fait passer une suspension cellulaire focalisée cellule par cellule devant un laser, puis des capteurs mesurent la lumière diffusée ou la fluorescence de chaque cellule.

• La cytométrie en flux mesure:

  • La taille
  • La densité ou granulosité cellulaire
  • La fluorescence

• L’iodure de propidium est un agent intercalant de l’ADN dont la fluorescence est proportionnelle à la quantité d’ADN et varie selon la phase du cycle cellulaire.

• Le FACS trie les cellules selon leur fluorescence en chargeant électriquement les gouttes qui les contiennent, puis en les déviant dans des champs électriques selon leur charge.

Compléments

• En immunocyto-fluorescence, l’intensité de fluorescence est proportionnelle au taux d’expression du marqueur de surface.

💡 Astuce mémo

Focaliser → éclairer → détecter → mesurer ou trier

📖 9. Modification de l’expression génique

🔑 Notions clés & Définitions

• Plasmide : Molécule d’ADN circulaire bicaténaire couramment utilisée comme vecteur d’expression non viral.

★ À maîtriser

📌 Un gène étranger peut être introduit dans une cellule eucaryote par transfection avec un vecteur non viral ou par infection avec un vecteur viral.

• Un plasmide d’expression contient:

  • Une région promotrice
  • Un gène de résistance à un antibiotique
  • Des sites de restriction
  • Un gène d’intérêt associé par une ligase

• Lors d’une infection virale, le gène d’intérêt est introduit dans un vecteur viral, ajouté au milieu, fixé aux récepteurs membranaires puis intégré dans la cellule, permettant son expression.

• Un siRNA est un petit ARN bicaténaire d’environ vingt nucléotides qui, après reconnaissance par le complexe RISC, se fixe aux ARNm correspondants et provoque leur dégradation ou inhibe leur traduction.

Compléments

📌 La lipofection utilise des lipides cationiques organisés en liposomes, l’électroporation crée des pores par un champ électrique et la micro-injection introduit du matériel dans une ou quelques cellules sous microscope.

💡 Astuce mémo

Transfection = vecteur non viral ; infection = vecteur viral

📖 10. Protéines de fusion et microscopie

🔑 Notions clés & Définitions

• Protéine de fusion : Associe une protéine d’intérêt à une étiquette codée par une séquence nucléotidique fusionnée à son ADN codant.

★ À maîtriser

• Une protéine de fusion permet de:

  • Détecter la protéine d’intérêt
  • Purifier la protéine d’intérêt
  • Visualiser la protéine dans des cellules vivantes

• La purification par étiquette GST repose sur l’affinité de la GST pour le glutathion : les billes recouvertes de glutathion retiennent la protéine de fusion dans le culot après centrifugation, tandis que les autres protéines restent dans le surnageant.

• La GFP est une protéine fluorescente verte qui permet d’observer en temps réel la dynamique des organites sans fixer les cellules.

Compléments

📌 Le microscope à fluorescence classique observe la fluorescence sur toute l’épaisseur de la cellule, tandis que le microscope confocal l’apprécie dans un seul plan cellulaire.

• 🔄 La détection intracellulaire nécessite:
  1. La fixation au paraformaldéhyde
  2. La perméabilisation par un agent comme le Triton X-100
  3. L’entrée des anticorps dans la cellule

💡 Astuce mémo

Fusionner → exprimer → détecter, purifier ou visualiser

📖 11. Applications biomédicales

★ À maîtriser

• Les anticorps servent au diagnostic du VIH et à la détection de la HCG dans les tests de grossesse.

• Le trastuzumab est un anticorps monoclonal utilisé contre le cancer du sein, tandis que l’ipilimumab est utilisé dans le traitement du mélanome.

Compléments

• Les modèles organ on a chip et body on a chip reproduisent respectivement un organe ou plusieurs petits organes communicants sur de petits dispositifs à partir de cellules isolées de biopsies.

• La bio-imprimante 3D peut imprimer une matrice extracellulaire et potentiellement des tissus greffables.

• Les travaux de Tasuku Honjo et James P. Allison sur des anticorps levant l’inhibition du système immunitaire dans certains cancers ont reçu des prix Nobel de médecine en 2018.

📖 12. SynthesisTables

★ À maîtriser

📌 Les cultures primaires sont proches des conditions in vivo mais sont longues à préparer, coûteuses, difficiles à maintenir en vie et peu facilement modifiables génétiquement, tandis que les lignées permettent une utilisation prolongée.

Compléments

• Les cultures primaires peuvent être maintenues en vie pendant 24 à 48 heures, voire une semaine au maximum, et les îlots β pancréatiques peuvent être greffés chez des patients diabétiques.

📊 Tableaux de synthèse

Types de lignées cellulaires

Méthodes de détection