Fiche de révision : Microscopie et techniques cellulaires

📋 Plan du Cours

1. Microscopie à contraste de phase
2. Principes de fluorescence et fluorochromes
3. Formation de l’image fluorescente
4. Applications et sécurité en fluorescence
5. Fractionnement cellulaire par centrifugation
6. Préparation de l’ADN génomique

📖 1. Microscopie à contraste de phase

★ À maîtriser

• La microscopie à contraste de phase permet d’étudier des cellules vivantes en observant le noyau, la distribution des organites cytoplasmiques, la division et les mouvements cellulaires.

• Le contraste de phase convient aux préparations qui n’absorbent pas la lumière, mais introduisent des différences de chemin optique dans les rayons lumineux.

Compléments

• La fixation d’un appareil spécial au microscope permet souvent de filmer les images obtenues en contraste de phase.

📖 2. Principes de fluorescence et fluorochromes

🔑 Notions clés & Définitions

• Fluorochrome : Substance présentant une forte fluorescence, capable d’emmagasiner de l’énergie et de la libérer sous forme de lumière.

★ À maîtriser

• Lors de la fluorescence, l’absorption d’énergie lumineuse fait passer une molécule de l’état fondamental à l’état excité, puis son retour à l’état fondamental s’accompagne de l’émission d’un rayonnement moins énergétique et de plus grande longueur d’onde.

• En microscopie de fluorescence, les préparations examinées contiennent des fluorochromes que le rayonnement ultraviolet excite afin de faire fluorescer les zones qui en contiennent.

• Dans le microscope à fluorescence, une lampe à vapeurs de mercure émet les rayons ultraviolets, un filtre d’excitation sélectionne ceux qui excitent le fluorochrome, puis un filtre de barrage arrête la lumière de la source et laisse passer la lumière émise par le fluorochrome vers l’oculaire.

Compléments

• Un fluorochrome peut être associé à un anticorps ayant une affinité pour une structure, ou posséder une affinité libre pour certaines structures.

• Le trajet des rayons ultraviolets dans le microscope de fluorescence passe par un condenseur, l’objectif et la lame de préparation, qui sont en verre de quartz parce que le verre ordinaire absorbe les ultraviolets.

• En microscopie de fluorescence, les zones fluorescentes apparaissent illuminées sur un fond sombre.

💡 Astuce mémo

Absorption d’énergie → excitation → émission lumineuse moins énergétique.

📖 3. Formation de l’image fluorescente

★ À maîtriser

📌 L’examen par transmission utilise des préparations transparentes ou des sections traversables par la lumière et induit la fluorescence dans toute leur masse, tandis que l’examen par réflexion induit la fluorescence à la surface de la préparation par illumination depuis le dessus avec l’objectif.

Compléments

• En transmission, l’observation des zones fluorescentes se fait par comparaison avec les zones sans fluorescence.

• L’examen en transmission peut être combiné à l’observation de la structure par absorption de la lumière polychromatique du spectre visible afin d’identifier la structure et les zones d’intérêt.

• En examen par réflexion, les rayons ultraviolets sont filtrés pour sélectionner la longueur d’onde qui excite la préparation, puis la lumière d’excitation est réfléchie par un prisme à réflexion totale et dirigée dans l’objectif.

• En examen par réflexion, le filtre de barrage protège l’œil contre les ultraviolets susceptibles d’être réfléchis par la préparation, et les zones fluorescentes apparaissent étincelantes sur fond sombre.

📖 4. Applications et sécurité en fluorescence

★ À maîtriser

• La microscopie de fluorescence sert à observer : certaines préparations colorées vitales, les lysosomes qui accumulent des colorants fluorescents comme l’acridine orange, les chromosomes et leurs bandes fluorescentes, le chromosome Y

• L’étude de la mobilité des protéines membranaires après fusion de cellules humaines et de cellules de souris a montré la fluidité membranaire.

📌 Il ne faut jamais regarder dans un microscope à fluorescence avant de vérifier que les filtres de barrage sont en place, car les ultraviolets peuvent provoquer instantanément de graves lésions rétiniennes.

Compléments

• La microscopie de fluorescence est utilisée :
  • en immunofluorescence
  • en histochimie
  • en cytochimie

📌 Après l’allumage de la lampe du microscope à fluorescence, il faut attendre au moins 15 minutes avant l’observation et la laisser refroidir environ 2 heures après son extinction avant de la rallumer.

📖 5. Fractionnement cellulaire par centrifugation

★ À maîtriser

• Le fractionnement différentiel d’un homogénat de foie de rat à 10 % commence par une centrifugation à 600 g pendant 10 minutes, qui sépare un culot contenant les noyaux, les cellules et les débris du surnageant.

• Après centrifugation du premier surnageant à 10 000 g pendant 10 minutes, le deuxième culot contient les mitochondries, les lysosomes et les peroxysomes.

• Après centrifugation du deuxième surnageant à 100 000 g pendant 60 minutes, le troisième culot contient les microsomes.

Compléments

• Après la séparation des microsomes, le troisième surnageant correspond au cytosol.

• Le deuxième surnageant peut aussi être centrifugé à 10 000 g pendant 10 minutes en présence de CaCl₂ pour obtenir le culot de microsomes.

💡 Astuce mémo

Culot 1 : noyaux et débris → culot 2 : organites → culot 3 : microsomes.

📖 6. Préparation de l’ADN génomique

★ À maîtriser

• La préparation de l’ADN génomique commence généralement par la lyse des cellules ou des tissus, éventuellement accompagnée d’un broyage, puis par une extraction à l’aide de détergents.

• Le SDS (sodium dodécyl sulfate) disperse les bicouches lipidiques des membranes et dénature les protéines, notamment celles associées à l’ADN dans la chromatine.

Compléments

• Après la lyse et l’extraction, la solution obtenue est généralement très visqueuse parce que l’ADN libéré y forme un élément dont la suite n’est pas précisée.

💡 Astuce mémo

Lyse, éventuellement broyage, puis extraction par détergents.

📊 Tableaux de synthèse

Modes d’examen en fluorescence