Fiche de révision : Milieux de culture animale in vitro

📋 Plan du Cours

1. Rôles et exigences des milieux
2. Composition du milieu de base
3. Sérum et milieux définis
4. Exemple de milieu DMEM
5. Prévention des contaminations
6. Conditions physico-chimiques de culture

📖 1. Rôles et exigences des milieux

🔑 Notions clés & Définitions

• Milieu de culture animale : Assure la nutrition et le support des cellules, contribue au maintien du pH et de l’osmolarité, et doit être stérile.

💡 Astuce mémo

Nourrir → soutenir → stabiliser → stériliser

📖 2. Composition du milieu de base

🔑 Notions clés & Définitions

• Base minimale : Milieu synthétique de composition parfaitement maîtrisée contenant les éléments indispensables aux cellules, comme les milieux MEM, DMEM, RPMI et HAM.

★ À maîtriser

• Les minéraux du milieu sont:

  • sodium
  • potassium
  • calcium
  • magnésium
  • phosphate
  • carbonate
  • chlore

• Le D-glucose est le substrat énergétique généralement utilisé à une concentration de 1 g.L-1, correspondant à la concentration physiologique du sang humain.

• En plus de la L-glutamine, douze acides aminés sont indispensables à la synthèse protéique ; la L-glutamine est très instable à 37 °C et doit être ajoutée extemporanément.

Compléments

• Les huit vitamines indispensables sont:
  • choline
  • acide folique
  • pyridoxal
  • riboflavine
  • thiamine
  • inositol
  • acide nicotinique
  • acide pantothénique

📖 3. Sérum et milieux définis

🔑 Notions clés & Définitions

• Sérum : Additif complexe et incomplètement défini, généralement du sérum de veau fœtal, de veau nouveau-né ou de cheval, ajouté à raison de 5 à 20 % selon le type cellulaire.

★ À maîtriser

• Le sérum apporte des facteurs de croissance, des oligoéléments, des vitamines et des hormones, favorise l’adhérence, l’étalement et la prolifération cellulaires, et inhibe la trypsine.

📌 Les sérums animaux peuvent être contaminés par des virus ou des mycoplasmes, et leurs concentrations variables en hormones et facteurs de croissance entraînent une variation du pouvoir prolifératif selon les lots.

Compléments

📌 Un milieu totalement défini est un milieu synthétique sans sérum dont la composition est rigoureusement connue, mais son usage reste limité car il ne convient qu’à très peu de lignées cellulaires.

💡 Astuce mémo

Sérum riche mais variable, milieu défini maîtrisé mais limité

📖 4. Exemple de milieu DMEM

📝 Points essentiels

• Le milieu DMEM est complété extemporanément par:
  • 10 % de sérum de veau fœtal
  • pénicilline à 100 U.mL-1
  • streptomycine à 100 μg.mL-1
  • Fungizone à 2,5 μg.mL-1

📖 5. Prévention des contaminations

🔑 Notions clés & Définitions

• Mycoplasmes : Bactéries sans paroi dont le diamètre est compris entre 0,1 et 0,3 μm ; ils perturbent la croissance, la viabilité, le caryotype et l’expression phénotypique des cellules cultivées.

★ À maîtriser

• Les contaminations peuvent provenir:

  • du sérum
  • du milieu
  • des réactifs
  • des cellules
  • de l’air
  • de l’eau
  • des mains du technicien
  • du matériel de culture

• La prévention des contaminations comprend le test et le traitement des cellules reçues, la désinfection des surfaces après chaque culture, le nettoyage régulier de la pièce et l’absence de mouchage ou de toux devant la hotte.

Compléments

• Les mycoplasmes déshydratés restent viables pendant 7 à 10 jours et peuvent contaminer la verrerie, les mains et la surface de travail malgré de bonnes conditions d’asepsie.

• Les mycoplasmes peuvent être détectés par DAPI, par fluorochrome de Hoechst ou par PCR, et leur traitement a une efficacité variable selon la lignée cellulaire.

💡 Astuce mémo

Contamination → baisse de viabilité et dérèglement cellulaire

📖 6. Conditions physico-chimiques de culture

★ À maîtriser

• La température de culture est de 37 °C en étuve et le pH doit être maintenu entre 7,2 et 7,4.

📐 Formule — Le tampon minéral repose sur l’équilibre $CO_2 + H_2O \rightleftharpoons H_2CO_3 \rightleftharpoons HCO_3^- + H_3O^+$ et $HCO_3^- \rightleftharpoons CO_2 + OH^-$.

• L’atmosphère de culture contient:
  • azote
  • oxygène à 21 %
  • CO₂ à 5 %
  • vapeur d’eau

Compléments

• Le rouge de phénol indique le pH en devenant jaune en milieu acide et rouge en milieu basique.

• Le CO₂ n’agit pas seulement sur le pH : il intervient aussi dans la prolifération cellulaire par sa participation à la biosynthèse des bases puriques et pyrimidiques.

💡 Astuce mémo

37 °C → pH 7,2–7,4 → 5 % CO₂ → 84–85 % d’humidité

📊 Tableaux de synthèse

Types de milieux de culture