Fiche de révision : Observation microbiologique

📋 Plan du Cours

1. Familles microbiennes et types cellulaires
2. Structure et éléments bactériens
3. Génome et capside virale
4. Enveloppe et multiplication virale
5. Fragilité des virus enveloppés
6. Microscopes optique et fluorescent
7. Microscopes électroniques
8. Examens et colorations bactériologiques
9. Étapes et résultats du Gram
10. Formes et arrangements bactériens
11. Composition et types de milieux
12. Milieux chromogènes et identification
13. Contrôle des milieux de culture
14. Colonies et dénombrement bactérien
15. Gestion des déchets infectieux

📖 1. Familles microbiennes et types cellulaires

★ À maîtriser

• Les principales familles microbiennes sont :
  • les bactéries
  • les virus
  • les champignons microscopiques
  • les protozoaires

📌 Les cellules eucaryotes possèdent un noyau, des organites et un cytosquelette, tandis que les cellules procaryotes n’en possèdent aucun.

• La plaque dentaire contient environ 250 milliards de bactéries par gramme de poids humide.

Compléments

• Les principales bactéries de la plaque dentaire sont :
  • les streptocoques
  • les corynébactéries
  • les peptostreptocoques

💡 Astuce mémo

Procaryote sans noyau, eucaryote avec noyau

📖 2. Structure et éléments bactériens

🔑 Notions clés & Définitions

• Paroi bactérienne : L’enveloppe qui forme l’exosquelette de la bactérie et qui est constituée de peptidoglycane.
• Cytoplasme bactérien : Le contenu de la cellule vivante, sous forme d’hydrogel dont le pH est compris entre 7 et 7,2.

★ À maîtriser

• La paroi bactérienne permet de différencier les bactéries Gram positives des bactéries Gram négatives et les aide à résister à une pression interne de 5 à 20 atmosphères.

• L’ADN chromosomique bactérien n’est pas entouré d’une membrane et est présent en un seul exemplaire, dit haploïde.

• Les plasmides sont de petits éléments d’ADN extrachromosomiques capables d’autoréplication, qui peuvent notamment apporter une résistance aux antibiotiques.

Compléments

• La capsule, produite par certaines bactéries selon l’espèce et le milieu, entoure la paroi, contribue à la défense contre les prédateurs et empêche le phagocytage.

• Les flagelles permettent le déplacement de la bactérie dans les milieux aqueux, tandis que les pili permettent l’adhésion aux surfaces et que les pili sexuels transmettent l’ADN entre bactéries.

📖 3. Génome et capside virale

🔑 Notions clés & Définitions

• Génome viral : Constitué d’ADN ou d’ARN, il peut être monocaténaire ou bicaténaire.
• Capside : Une structure protéique qui enveloppe et protège le génome viral.
• Nucléocapside : La structure compacte formée par l’assemblage de la capside autour du génome viral.

★ À maîtriser

📌 La réplication des virus à ARN est généralement moins fidèle que celle des virus à ADN, ce qui rend les virus à ARN particulièrement sujets aux variations génétiques.

Compléments

📌 La taille du génome et les capacités de codage sont plus importantes chez les virus à ADN que chez les virus à ARN.

• La capside virale peut avoir une conformation tubulaire ou polyédrique.

📖 4. Enveloppe et multiplication virale

🔑 Notions clés & Définitions

• Péplos : L’enveloppe externe présente chez certains virus et dérivée d’une membrane cellulaire.

★ À maîtriser

• 🔄 La sortie d’un virus enveloppé se déroule ainsi : la capside et le génome s’assemblent en nucléocapside sous la membrane cytoplasmique, le virus sort par bourgeonnement de la membrane, le bourgeon s’isole et forme un virus libre capable d’infecter une nouvelle cellule ou un nouveau sujet

• Un virus doit être entier pour être infectant.

Compléments

• L’enveloppe du virus de la grippe dérive de la membrane cytoplasmique de la cellule infectée et est modifiée par l’adjonction de glycoprotéines.

📌 Les virus nus sont dépourvus de péplos, contrairement aux virus enveloppés; les poliovirus sont des exemples de virus nus.

📌 Le péplos peut protéger les virus contre des enzymes ou des composés chimiques, mais rend le virus plus fragile en raison de la fragilité des membranes cellulaires dont il dérive.

💡 Astuce mémo

Assemblage sous la membrane → bourgeonnement → libération du virus

📖 5. Fragilité des virus enveloppés

★ À maîtriser

• Les virus enveloppés sont sensibles aux détergents, à la dessiccation et à la température dans l’environnement extérieur.

• Dans le tube digestif, les enzymes digestives et le pH acide de l’estomac dégradent rapidement l’enveloppe des virus à péplos.

Compléments

• La dégradation de l’enveloppe dans l’environnement extérieur ou le tube digestif peut faire perdre aux virus enveloppés leur pouvoir infectieux.

💡 Astuce mémo

Enveloppe fragile → perte du pouvoir infectieux dans certains milieux

📖 6. Microscopes optique et fluorescent

★ À maîtriser

• Le microscope optique utilise la lumière visible et une série de lentilles de verre polies pour agrandir l’image des microorganismes et de certains de leurs détails.

📐 Formule - Le grossissement total est égal au grossissement de l’objectif multiplié par celui de l’oculaire : $G_{total}=G_{objectif}\times G_{oculaire}$.

• En microscopie à fluorescence, le fluorochrome absorbe la lumière UV à courte longueur d’onde et émet une lumière visible de longueur d’onde plus longue.

Compléments

• Un objectif 10× donne un grossissement total de 100×, utilisé notamment pour observer des levures.

• Un objectif à immersion 100× donne un grossissement total de 1000×, utilisé notamment pour observer des bactéries après coloration de Gram.

• Un microorganisme marqué au fluorochrome apparaît brillant sur un fond noir en microscopie à fluorescence.

• La microscopie à fluorescence est utilisée pour le diagnostic microbiologique de la tuberculose ; après coloration à l’auramine, Mycobacterium tuberculosis apparaît en jaune vif sur fond noir.

📖 7. Microscopes électroniques

★ À maîtriser

• Les microscopes électroniques utilisent un faisceau d’électrons libres, des lentilles électromagnétiques et produisent des images en noir et blanc.

• Le microscope électronique à transmission (MET) grossit de 10000 à 100000× et distingue des objets séparés de 2,5 nm.

• Le MET exige des coupes d’environ 100 nm, produit des images en deux dimensions et nécessite un échantillon fixé et déshydraté, ce qui tue et déforme les microorganismes.

• Le microscope électronique à balayage (MEB) grossit de 1000 à 10000× et distingue des objets séparés de 10 nm.

• Le MEB fournit des images en trois dimensions et permet d’observer la morphologie et la structure externe des cellules intactes et des virus, y compris dans leur environnement naturel.

Compléments

• Les microscopes électroniques sont utilisés notamment pour examiner les objets de moins de 0,2 μm, comme les virus ou les structures internes des cellules.

• Pour le MET, le spécimen est déposé sur une grille en cuivre et coloré avec des sels de métaux lourds tels que le plomb et l’osmium.

• En MEB, un faisceau d’électrons balaie la surface du spécimen, et l’échantillon peut être recouvert d’une fine couche d’or par pulvérisation cathodique pour le rendre conducteur électrique.

💡 Astuce mémo

Le MET traverse l’échantillon ; le MEB balaie sa surface

📖 8. Examens et colorations bactériologiques

★ À maîtriser

• Les méthodes d’observation des bactéries comprennent :

  • un milieu de culture solide
  • un examen microscopique direct
  • un examen à l’état frais
  • un examen après coloration

• L’examen microscopique direct ou à l’état frais observe des cellules vivantes entre lame et lamelle afin de déterminer la diversité microbienne, les formes cellulaires, la mobilité et le mode de regroupement.

📌 Une coloration simple utilise un seul colorant, parfois accompagné d’un mordant, tandis qu’une coloration différentielle utilise au moins deux colorants et comprend une étape de décoloration.

• La préparation d’un frottis consiste à étendre aseptiquement une mince couche d’échantillon sur une lame propre, puis à la sécher à l’air près du bec Bunsen.

Compléments

• Le bleu de méthylène et la fuchsine sont des exemples de colorants simples, tandis que le Gram et le Ziehl-Neelsen sont des colorations différentielles.

• Les colorations simples et différentielles permettent d’étudier la diversité microbienne, la forme des cellules et leur mode de regroupement ; les colorations différentielles déterminent aussi le caractère tinctorial.

• La fixation du frottis s’effectue par plusieurs passages rapides au-dessus de la flamme d’un bec Bunsen, ce qui tue les microorganismes et les fait adhérer à la lame tout en déformant peu certaines structures cellulaires.

• Pour colorer un frottis, on le couvre de colorant, on laisse agir celui-ci, puis on rince à l’eau ; les colorants se fixent aux cellules par des liaisons chimiques.

📖 9. Étapes et résultats du Gram

🔑 Notions clés & Définitions

• Coloration de Gram : Technique de base en microbiologie et en microscopie optique qui différencie deux groupes bactériens selon la composition de leur paroi et oriente leur identification.

★ À maîtriser

• La coloration de Gram suit l’ordre suivant : cristal violet, lugol, alcool, puis fuchsine.

📌 Les bactéries à paroi Gram négative, dont la couche de peptidoglycane est mince, perdent le cristal violet sous l’action de l’alcool et deviennent incolores avant l’ajout de fuchsine.

📌 Les bactéries à paroi Gram positive, dont la couche de peptidoglycane est plus épaisse, retiennent le cristal violet après l’alcool et restent violettes, la fuchsine étant masquée par ce colorant plus foncé.

Compléments

• Le cristal violet se fixe au niveau du peptidoglycane bactérien, puis le lugol le stabilise afin qu’il s’échappe moins facilement de la paroi.

• La coloration de Gram permet de :

  • visualiser la morphologie d’une souche
  • visualiser le mode de groupement d’une souche
  • vérifier la pureté d’une souche

💡 Astuce mémo

Violet, lugol, alcool, fuchsine

📖 10. Formes et arrangements bactériens

★ À maîtriser

• Les trois formes principales des bactéries sont les cocci sphériques, les bacilles en bâtonnet ou cylindriques et les spirilles hélicoïdales, qui ne sont jamais droites.

• Les arrangements de cocci comprennent les diplocoques en paires, les streptocoques en chaînettes, les tétrades en groupes de quatre, les sarcines en groupes de huit et les staphylocoques en grappes issues de divisions dans de nombreuses directions.

📌 Les vibrillons sont des bâtonnets incurvés en forme de virgule, les spirilles ont une paroi rigide et des flagelles polaires, tandis que les spirochètes ont une paroi souple et des endoflagelles.

Compléments

📌 Les bactéries monomorphes conservent toujours la même forme, tandis que les bactéries pléomorphes peuvent en présenter plusieurs, comme celles du genre Corynebacterium.

• Les Actinomycètes peuvent former des filaments ramifiés ou non qui constituent un mycélium.

• Les diplobacilles sont des bacilles groupés par paires, les streptobacilles forment des chaînettes et les cocobacilles ont une forme intermédiaire entre les cocci et les bacilles.

• Vibrio cholerae est associé au choléra et présente une forme caractéristique de bacille en virgule.

• Treponema pallidum est l’agent de la syphilis et constitue un exemple de spirochète.

📖 11. Composition et types de milieux

🔑 Notions clés & Définitions

• Milieu de culture : Support permettant la culture de cellules, de bactéries, de levures ou de moisissures afin de les étudier.
• Milieu minimum : Milieu contenant les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance de bactéries sans exigence particulière, sous une forme utilisable par celles-ci.
• Milieu empirique : Milieu contenant des produits d’origine naturelle dont la composition exacte est inconnue.
• Milieu sélectif : Milieu permettant uniquement la culture de certains genres de micro-organismes grâce à des éléments qui inhibent les micro-organismes indésirables.
• Milieu enrichi : Milieu contenant, en plus des composants de base, des éléments indispensables que certaines bactéries ne peuvent pas synthétiser; il sert à cultiver des bactéries exigeantes ou auxotrophes.
• Milieu différentiel : Milieu permettant de distinguer deux types de micro-organismes qui se développent dans le même milieu en révélant des caractéristiques biochimiques, principalement la dégradation d’un substrat.

★ À maîtriser

• Un milieu minimum comporte les sources et composants suivants :

  • Carbone et énergie, généralement le glucose
  • Potassium et phosphore : K2HPO4
  • Azote et soufre : (NH4)2SO4
  • Magnésium : MgCl2
  • Calcium : CaCl2
  • Fer, notamment sous forme de citrate de fer
  • Oligo-éléments : sels de Cu, Zn, Co, Ni, B et Ti
  • Eau distillée stérile et tampon de pH, par exemple KH2PO4

• La gélose Hektoën différencie la fermentation du lactose, du saccharose et de la salicine, ainsi que la production de sulfure d’hydrogène.

• La gélose Hektoën est sélective des bacilles à Gram négatif et particulièrement adaptée à la recherche d’entérobactéries pathogènes dans les selles.

Compléments

• Un milieu de culture peut contenir une base composée notamment d’agar-agar, d’eau et de minéraux, ainsi qu’un indicateur coloré de pH ou d’oxydoréduction.

📌 Un bouillon de culture remplit la même fonction qu’un milieu de culture solide, mais ne contient pas d’agar-agar et reste totalement liquide.

📌 En l’absence de l’un des composants d’un milieu minimum, les bactéries ne se développent pas parce qu’elles ne peuvent pas synthétiser les produits manquants; l’ajout de facteurs de croissance appropriés permet le développement de bactéries exigeantes.

• Le milieu cœur-cervelle contient de l’eau, de l’agar-agar et des hydrolysats de cœur et de cervelle de composition qualitative et quantitative inconnue; il sert uniquement à la croissance bactérienne et n’a pas d’effet sélectif.

• L’œuf de poule embryonné a servi à la culture de virus dès les années 1930, puis a été le plus souvent supplanté dans les laboratoires de recherche par la culture cellulaire à partir des années 1950; il reste utilisé pour produire le vaccin antigrippal.

• Le milieu SS permet la croissance des Salmonelles; Shigella s’y développe plus lentement et nécessite environ 48 à 72 heures avant d’obtenir une culture exploitable.

• La gélose Kana-Vanco inhibe les bactéries à Gram positif par la vancomycine et la plupart des entérobactéries par la kanamycine, favorisant la pousse des bactéries anaérobies strictes.

💡 Astuce mémo

Le milieu minimum est défini, le milieu empirique ne l’est pas

📖 12. Milieux chromogènes et identification

🔑 Notions clés & Définitions

• Milieu chromogène : Un milieu chromogène, ou discriminant, peut être sélectif ou non et révèle une enzyme bactérienne spécifique par la coloration d’un chromogène associé à son substrat.

★ À maîtriser

• 🔄 La révélation chromogène suit cette séquence :

  1. Une enzyme bactérienne spécifique métabolise un substrat couplé à un chromogène.
  2. Le chromogène prend une couleur particulière et devient un chromophore.
  3. La couleur est directement lisible sur la colonie.

• Le milieu CPS E est non sélectif et adapté au diagnostic des infections urinaires ; il met en évidence l’activité bêta-glucuronidase d’Escherichia coli, responsable de 80 % des cystites en France et de 40 % à l’hôpital.

Compléments

• Lorsque l’enzyme révélée n’existe que chez une espèce bactérienne donnée, le milieu chromogène permet une identification immédiate.

• Sur CPS E, Escherichia coli forme des colonies rose-bordeaux, les entérocoques des colonies bleu turquoise et les bactéries du groupe KESC des colonies vert-bleu.

• Sur CPS E, la mise en évidence de l’activité tryptophane désaminase oriente vers Proteus, dont les colonies sont entourées d’une zone de précipitation brune.

• Le milieu SM2 est sélectif des bactéries à Gram négatif et révèle Salmonella dans les selles par une activité estérase spécifique.

• Le milieu CAN2 est sélectif des levures et révèle Candida albicans par son activité hexosaminidase.

• Les milieux chromogènes cités et leurs cibles sont :

  • SAID pour Staphylococcus aureus
  • MRSA pour la recherche des SARM
  • ESBL pour la recherche des BLSE
  • STRB pour la recherche des streptocoques du groupe B

💡 Astuce mémo

Enzyme spécifique → chromogène coloré → identification de la bactérie

📖 13. Contrôle des milieux de culture

★ À maîtriser

📌 Depuis 2014, la norme ISO 11133 impose des contrôles réguliers de la performance des milieux de culture.

📌 Les laboratoires contrôlent les milieux pré-coulés tous les ans et les milieux fabriqués sur place tous les trois mois ou à chaque changement de lot.

Compléments

• Les fabricants contrôlent la performance de chaque lot de milieu.

📖 14. Colonies et dénombrement bactérien

🔑 Notions clés & Définitions

• Colonie : En microbiologie et en biologie cellulaire, un ensemble de micro-organismes ou de cellules identiques qui se développent sur ou dans une surface solide, comme un milieu de culture ou un aliment.
• Dénombrement bactérien : Une technique de microbiologie qui estime le nombre de bactéries présentes dans un échantillon.
• Plus probable nombre : Une méthode statistique qui estime le nombre de bactéries viables, notamment dans les échantillons où elles croissent mal sur milieu solide.

★ À maîtriser

• La méthode des dilutions en série consiste à diluer l’échantillon, à étaler une petite quantité de chaque dilution sur gélose, puis à compter les colonies après incubation ; elle distingue les bactéries vivantes des mortes, mais l’incubation prend du temps et la méthode peut manquer de précision aux concentrations très élevées ou très faibles.

Compléments

• Les micro-organismes d’une colonie proviennent d’un même ancêtre et forment des clones génétiquement identiques, à l’exception de mutations pouvant survenir à faible fréquence.

• La taille d’une colonie varie de quelques micromètres à plusieurs millimètres, taille à laquelle elle est visible à l’œil nu.

• Le comptage direct au microscope utilise une chambre de comptage, comme la chambre de Neubauer, pour compter des bactéries colorées ; il permet de les observer directement, mais peut être fastidieux et ne distingue pas les bactéries vivantes des mortes.

• La turbidimétrie estime la quantité de bactéries à partir de l’opacité de la culture ; elle est rapide et automatisable, mais moins précise, ne distingue pas les bactéries vivantes des mortes et nécessite une calibration avec des échantillons de concentration connue.

• Le comptage par fluorescence utilise des colorants liés aux acides nucléiques bactériens et un cytomètre de flux ou un microscope à fluorescence ; il est rapide, certains colorants distinguent les cellules vivantes des mortes, mais il nécessite un équipement spécialisé et onéreux.

• La méthode MPN est utile pour les échantillons à nutriments limités ou soumis à des conditions de croissance spécifiques, mais elle est moins précise et plus coûteuse en temps et en matériel.

📌 Le choix d’une méthode de dénombrement dépend de l’objectif de l’étude, du type d’échantillon et des ressources disponibles, et des résultats fiables exigent le respect des protocoles ainsi que la prise en compte de la viabilité bactérienne et des conditions de croissance.

📖 15. Gestion des déchets infectieux

🔑 Notions clés & Définitions

• DASRI : Les déchets d’activités de soins à risques infectieux (DASRI) sont des déchets issus des activités de diagnostic, de suivi et de traitement préventif, curatif ou palliatif en médecine humaine ou vétérinaire, ainsi que certains déchets d’enseignement, de recherche et de production industrielle en médecine humaine.

★ À maîtriser

📌 Sont considérés comme DASRI les déchets présentant un risque infectieux parce qu’ils contiennent des micro-organismes viables ou leurs toxines, susceptibles, par leur nature, leur quantité ou leur métabolisme, de causer une maladie chez l’être humain ou d’autres organismes vivants.

📌 L’incinération détruit les DASRI dans des fours dédiés, tandis que la banalisation neutralise leur risque infectieux par désinfection avant de les orienter vers la filière des ordures ménagères classiques.

Compléments

• Les DASRI sont stockés et transportés dans des conditionnements adaptés, puis éliminés par incinération ou banalisation.

• L’incinération des DASRI s’effectue dans des fours dédiés, dans une filière distincte de celle des déchets ménagers, à une température minimale de 850 degrés et fait généralement l’objet d’une valorisation énergétique.

• L’arrêté du 7 septembre 99 réglemente la production, le stockage, le transport et l’élimination des DASRI.

📌 Tous les producteurs de DASRI doivent mettre en place des solutions de collecte et d’élimination de leurs déchets infectieux et en garantir la traçabilité complète.

💡 Astuce mémo

Incinérer détruit les déchets ; banaliser neutralise le risque avant la filière ménagère