Le salting-out
Explication
Le salting-out correspond à une diminution de la solubilité des protéines due à l’augmentation de la concentration en sel. La dialyse, au contraire, sert à éliminer de petites molécules sans provoquer ce type de précipitation.
Le pH
Explication
Le pH change l’état de protonation des protéines, donc leur charge nette, ce qui modifie leur tendance à rester dissoutes. La masse moléculaire n’est pas le facteur direct de cette solubilité.
Laisser passer les petites molécules tout en retenant les protéines
Explication
En dialyse, la membrane semi-perméable permet le passage des petites molécules comme les sels, mais retient les protéines. Elle fonctionne donc comme un filtre de taille.
Les petites molécules diffusent vers l’extérieur tandis que les protéines restent dans la solution initiale
Explication
La dialyse repose sur la diffusion des petites molécules à travers la membrane jusqu’à l’équilibre, tandis que les protéines sont retenues. Il ne s’agit pas d’une transformation chimique.
Le papier
Explication
Le papier constitue la phase stationnaire en chromatographie sur papier. Le solvant correspond à la phase mobile, qui entraîne les composés plus ou moins loin.
Le rapport entre la distance parcourue par le composé et celle du front du solvant
Explication
Le Rf sert à comparer la migration d’un composé à celle du front du solvant. Il est utilisé pour identifier ou comparer des composés ayant un comportement chromatographique similaire.
La charge
Explication
L’électrophorèse simple sépare surtout les protéines selon leur charge. Ce n’est pas la masse qui est le critère principal dans ce cas.
Le SDS dénature les protéines et leur impose une charge négative liée à leur taille
Explication
Le SDS dénature les protéines et leur confère une charge négative proportionnelle à leur taille, ce qui rend la migration dépendante de la masse moléculaire. La charge native n’est donc plus le facteur dominant.
La taille des fragments d’ADN
Explication
L’électrophorèse sur agarose sépare les fragments d’ADN selon leur taille. Les plus petits migrent plus facilement dans le gel.
À la détection de l’ADN après transfert sur membrane
Explication
Le Southern blot est le blotting utilisé pour détecter l’ADN. Le Northern concerne l’ARN et le Western les protéines.
La migration des protéines jusqu’à un pH où leur charge nette est nulle
Explication
La focalisation isoélectrique sépare les protéines selon leur pI en les amenant au pH où leur charge nette devient nulle. C’est cette neutralité qui arrête leur migration.
Focalisation isoélectrique puis SDS-PAGE
Explication
L’électrophorèse bidimensionnelle combine d’abord une séparation selon le pI, puis une séparation selon la masse moléculaire en SDS-PAGE. Cette combinaison augmente fortement la résolution.
La méthode d’Edman
Explication
La méthode d’Edman séquence la protéine cycle par cycle à partir de l’extrémité N-terminale. Elle utilise le réactif PITC avant identification du résidu retiré.
Une digestion enzymatique préalable, souvent par la trypsine
Explication
La MS/MS analyse des fragments obtenus après digestion enzymatique, souvent par la trypsine. Elle déduit ensuite la séquence à partir des masses mesurées.
L’incorporation de ddNTP qui bloquent l’élongation
Explication
La méthode de Sanger utilise des ddNTP qui interrompent la synthèse lorsqu’ils sont incorporés. Les fragments obtenus sont ensuite lus par électrophorèse.
Illumina, Nanopore et PacBio
Explication
Le NGS regroupe notamment Illumina, Nanopore et PacBio. Ces technologies servent au séquençage à grande échelle de génomes, transcriptomes ou métagénomes.
Mémorisez les réponses avec 16 flashcards sur Techniques de séparation et séquençage des biomolécules.
Solubilité protéines — influence ?
Force ionique, pH, charge
Salting-out — mécanisme ?
Précipitation par augmentation du sel
pH — effet sur protéines ?
Modifie leur charge et solubilité
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