Fiche de révision : Techniques d’études de biologie cellulaire

📋 Plan du Cours

1. Pouvoir de résolution et imagerie cellulaire
2. Échantillons et préparation cellulaire
3. Microscope optique standard
4. Microscopes optiques spécialisés
5. Microscopie électronique MET et MEB
6. Microscope confocal
7. Études biochimiques in situ
8. Cytométrie et fractionnement cellulaire
9. Anticorps et dosage immunologique
10. Séparation et analyse moléculaire

📖 1. Pouvoir de résolution et imagerie cellulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Pouvoir de résolution : La plus petite distance observable entre deux points sans qu’ils soient confondus.
• Imagerie cellulaire : Regroupe la description morphologique des cellules et des tissus ainsi que l’étude in situ de leurs constituants biochimiques.

★ À maîtriser

• Plus la valeur D du pouvoir de résolution est petite, plus le microscope est puissant.

Compléments

• Le pouvoir de résolution de l’œil humain est de 0,2 mm.

• Le pouvoir de résolution dépend de l’indice de réfraction du milieu, de la longueur d’onde du faisceau et de la moitié de l’angle du cône lumineux entrant dans l’objectif.

💡 Astuce mémo

D petit = microscope plus puissant ; D grand = détails confondus

📖 2. Échantillons et préparation cellulaire

★ À maîtriser

• Les cellules vivantes peuvent être cultivées dans des boîtes de Pétri ou des tubes à 37 °C, dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2 et dans un milieu adapté avec des nutriments ou facteurs de croissance spécifiques.

• Les échantillons cellulaires comprennent: le sang, la moelle hématopoïétique, le liquide céphalo-rachidien, les urines, les épanchements pleural, péritonéal ou articulaire, le lavage broncho-alvéolaire, les frottis obtenus par brossage ou grattage

• 🔄 La préparation rapide par congélation suit ces étapes: congeler la biopsie dans l’azote liquide avec des cryoprotecteurs, couper la biopsie au cryostat à -20/-30 °C, fixer puis colorer les coupes

• 🔄 La préparation chimique suit ces étapes: fixer l’échantillon avec des aldéhydes ou de l’osmium, déshydrater puis inclure l’échantillon en paraffine ou en résine, refroidir et durcir l’inclusion, couper l’échantillon, contraster les coupes si nécessaire

Compléments

• Les échantillons tissulaires sont principalement obtenus par biopsie ou résection lors d’une intervention ou d’un prélèvement diagnostique.

• Pour réaliser un étalement cellulaire, une goutte de sang ou une suspension cellulaire est déposée sur une lame puis étalée ou laissée sécher afin d’obtenir une couche de cellules observable au microscope.

💡 Astuce mémo

Prélever → fixer ou congeler → couper → colorer

📖 3. Microscope optique standard

🔑 Notions clés & Définitions

• Microscope optique standard : Utilise des photons qui traversent successivement le condenseur, l’objectif et l’oculaire.

★ À maîtriser

• Le microscope optique standard possède généralement un objectif de grossissement x25, x40 ou x100 et un oculaire x10, pour un grossissement total pouvant atteindre environ 400x.

• Le microscope optique standard permet d’observer la forme et l’aspect des cellules et des noyaux, mais ne permet pas d’observer correctement les structures infracellulaires.

Compléments

• En microscopie optique standard, la préparation doit être fine et presque transparente, avec des coupes d’environ 5 μm et une coloration comme l’éosine ou l’hémalun.

💡 Astuce mémo

Condenseur → objectif → oculaire

📖 4. Microscopes optiques spécialisés

🔑 Notions clés & Définitions

• Microscope à contraste de phase : Transforme les différences de déviation et de phase des ondes lumineuses traversant les structures cellulaires en différences de brillance.
• Microscope à fluorescence : Détecte des molécules fluorescentes qui absorbent une lumière à une longueur d’onde et en émettent une autre de longueur d’onde supérieure.

★ À maîtriser

• Le microscope à contraste de phase ne nécessite ni coupe, ni fixation, ni coloration et permet d’observer des cellules vivantes, leurs mouvements et leur division.

Compléments

• Le microscope à fluorescence utilise un filtre d’excitation qui sélectionne la longueur d’onde absorbée et un filtre d’arrêt qui laisse passer la lumière émise par le fluorochrome.

• La fluorescéine absorbe dans le bleu et émet dans le jaune-vert, tandis que la rhodamine absorbe dans le vert et émet dans le rouge.

💡 Astuce mémo

Contraste de phase : cellules vivantes ; fluorescence : molécules marquées

📖 5. Microscopie électronique MET et MEB

🔑 Notions clés & Définitions

• Microscope électronique à transmission : Utilise un faisceau d’électrons qui traverse une coupe ultrafine placée dans un vide poussé et focalisée par des lentilles électromagnétiques.
• Microscope électronique à balayage : Dirige un faisceau d’électrons sur la surface d’un échantillon métallisé et détecte les électrons renvoyés pour produire une image en relief.

★ À maîtriser

• Le MET nécessite un échantillon fixé et mort, inclus en résine plastique, coupé à environ 50 nm, déposé sur une grille de cuivre ou de platine et contrasté par des métaux lourds.

• Le MET fonctionne sous une tension de 40 à 100 kV, atteint un pouvoir de résolution de 0,1 à 0,2 nm et permet d’observer les structures infracellulaires avec des grossissements allant jusqu’à 100 000x.

Compléments

• Le MEB utilise un échantillon fixé et mort, non coupé, recouvert de carbone, d’or ou de platine, et fonctionne sous une tension de 1 à 40 kV.

💡 Astuce mémo

MET traverse l’échantillon ; MEB balaie sa surface

📖 6. Microscope confocal

🔑 Notions clés & Définitions

• Microscope confocal : Microscope à fluorescence utilisant un laser pour réaliser des coupes optiques successives et reconstruire des images tridimensionnelles.

📝 Points essentiels

• Le microscope confocal permet d’observer des échantillons plus épais, d’obtenir une série de plans selon l’axe Z et de localiser plus précisément une molécule dans la cellule ou sur la membrane plasmique.

💡 Astuce mémo

Un laser scanne des plans successifs et empile les images en volume

📖 7. Études biochimiques in situ

🔑 Notions clés & Définitions

• Histochimie : Localise des constituants cellulaires ou tissulaires grâce à des réactions chimiques qui colorent les molécules.
• Immunohistologie : Localise des molécules antigéniques, surtout des protéines et des glycoprotéines, grâce à une interaction spécifique entre un antigène et un anticorps.
• Hybridation in situ : Localise une séquence d’acide nucléique grâce à une sonde simple brin marquée et complémentaire de la séquence recherchée.
• Autoradiographie : Suit dans le temps des macromolécules cellulaires grâce à des précurseurs radioactifs incorporés dans ces macromolécules.

★ À maîtriser

• La réaction PAS met en évidence des résidus glucidiques, tandis que la réaction de Feulgen-Rossenbeck met en évidence l’ADN des noyaux.

• L’histoenzymologie localise une enzyme en incubant une coupe avec son substrat puis en révélant le produit coloré de la réaction enzymatique.

📌 Le marquage immunohistologique direct utilise un anticorps directement couplé à un fluorochrome, une enzyme ou une bille d’or, tandis que le marquage indirect utilise un anticorps primaire puis plusieurs anticorps secondaires marqués qui amplifient le signal.

Compléments

• Dans la réaction à la peroxydase, la peroxydase transforme la diaminobenzidine en présence de H2O2 en un produit brun observable au microscope.

• Les sondes peuvent être:

  • de l’ADN bicaténaire
  • de l’ARN monocaténaire
  • des oligonucléotides

• En autoradiographie, le tissu est incubé avec une molécule radioactive, plongé dans une émulsion photographique pendant quelques jours à quelques semaines, puis révélé pour faire apparaître des grains d’argent noirs.

💡 Astuce mémo

Anticorps repère les protéines ; sonde nucléique repère les acides nucléiques

📖 8. Cytométrie et fractionnement cellulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Cytométrie de flux : Fait défiler des cellules marquées par des anticorps fluorescents afin de les différencier, les compter et les trier.

★ À maîtriser

• En cytométrie de flux, des anticorps fluorescents marquent les cellules en suspension, un laser excite les fluorochromes, les cellules passent une à une et un courant trie les gouttelettes selon leur fluorescence.

• La centrifugation différentielle sépare les constituants cellulaires en soumettant progressivement un homogénat et les surnageants successifs à des centrifugations de plus en plus rapides et longues.

• Une centrifugation de 10 minutes à 1000 g produit un culot contenant les noyaux et les débris cellulaires, tandis qu’une centrifugation du surnageant à 20 000 g pendant 20 minutes sédimente les mitochondries, les lysosomes et les péroxysomes.

Compléments

• La cytométrie de flux est utilisée pour: le typage des leucémies, la numération des sous-populations lymphocytaires, la formule du lavage broncho-alvéolaire, l’étude du cycle cellulaire et de la ploïdie des tumeurs

• Une centrifugation du surnageant à 80 000 g pendant 60 minutes produit un culot de fragments du réticulum endoplasmique appelés microsomes et un surnageant contenant principalement le cytosol.

💡 Astuce mémo

Marquer → mesurer et trier ; broyer → centrifuger → récupérer les culots

📖 9. Anticorps et dosage immunologique

🔑 Notions clés & Définitions

• ELISA indirecte : Dose un anticorps en le faisant reconnaître par un antigène fixé au fond d’un puits puis par un anticorps secondaire couplé à une enzyme produisant une coloration.
• ELISA sandwich : Dose un antigène capturé par un anticorps fixé au fond d’un puits puis reconnu par un second anticorps couplé à une enzyme produisant une coloration.

★ À maîtriser

• La fabrication d’anticorps monoclonaux consiste à immuniser une souris, récupérer ses lymphocytes B, les fusionner avec des cellules de myélome, sélectionner les clones producteurs, les amplifier puis récupérer les anticorps.

• Dans un ELISA, l’intensité de la coloration mesurée au spectrophotomètre dépend de la quantité initiale d’antigène ou d’anticorps et peut être interprétée avec une gamme étalon.

Compléments

• L’ELISA permet notamment de détecter dans des sérums des anticorps dirigés contre des protéines de l’enveloppe du VIH.

💡 Astuce mémo

Immuniser → fusionner → sélectionner → amplifier

📖 10. Séparation et analyse moléculaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie : Sépare et purifie les constituants d’un mélange grâce à une phase mobile et une phase fixe dans laquelle les molécules migrent à des vitesses différentes.
• Western Blot : Consiste à transférer les protéines séparées sur une membrane de nitrocellulose puis à détecter un antigène avec un anticorps marqué spécifique.

★ À maîtriser

📌 La chromatographie d’exclusion sépare les protéines uniquement selon leur taille grâce à des billes poreuses, tandis que la chromatographie d’affinité sépare les protéines selon leur reconnaissance spécifique par un ligand fixé à la colonne.

• En électrophorèse, les protéines sont dénaturées par chauffage avec du SDS et un agent réducteur, déposées dans un gel de polyacrylamide, séparées par un courant puis révélées par coloration ou Western Blot.

• Dans le gel de polyacrylamide, les petites protéines migrent plus vite et plus loin que les protéines de poids moléculaire élevé.

Compléments

• En chromatographie d’affinité, les protéines non reconnues traversent la colonne à pH 7, tandis que les protéines reconnues sont ensuite détachées de l’anticorps par un tampon acide à pH 3.

💡 Astuce mémo

Chromatographie sépare dans une colonne ; électrophorèse sépare dans un gel

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des principaux microscopes