Fiche de révision : Méthodes d’étude des cellules et tissus

📋 Plan du Cours

1. Histologie et échelles biologiques
2. Résolution et pouvoir séparateur
3. Microscopie optique classique
4. Fluorescence et fluorochromes
5. Microscopie confocale
6. Préparation des coupes histologiques
7. Colorations histologiques
8. Immunohistochimie

📖 1. Histologie et échelles biologiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Histologie : Étude microscopique de l’organisation des tissus au sein des organes.
• Cellule : Unité fondamentale de vie la plus simple capable de subsister de manière autonome et de se reproduire par divisions mitotiques ou méiotiques.

★ À maîtriser

• Les cinq tissus fondamentaux sont:
  • les épithéliums de revêtement et glandulaires
  • les tissus conjonctifs et squelettiques
  • les cellules sanguines et tissus hématopoïétiques
  • les tissus musculaires
  • les tissus nerveux

Compléments

• La taille moyenne d’une cellule est de 5 à 20 μm, ce qui la rend invisible à l’œil nu dont la limite de résolution est d’environ 200 μm.

📖 2. Résolution et pouvoir séparateur

📝 Points essentiels

📌 La limite de résolution est la distance minimale entre deux points pour qu’ils soient vus séparément, tandis que le pouvoir séparateur est la capacité à percevoir deux points adjacents comme distincts.

• Le microscope optique a une limite de résolution de 0,2 μm et permet d’observer les cellules et les plus gros organites, tandis que le microscope électronique atteint 0,2 nm et permet d’observer des organites comme les mitochondries, les lysosomes, l’appareil de Golgi et les peroxysomes.

📌 Plus la limite de résolution est faible, plus le pouvoir séparateur est grand.

💡 Astuce mémo

Limite de résolution faible → pouvoir séparateur élevé

📖 3. Microscopie optique classique

🔑 Notions clés & Définitions

• Contraste de phase : Rend visibles des structures biologiques transparentes non colorées en transformant leurs déphasages lumineux en différences d’intensité.

📝 Points essentiels

• 🔄 Dans un microscope optique, la lumière traverse successivement: le condenseur, qui uniformise l’éclairage et focalise le faisceau, l’objectif, qui forme une image réelle agrandie et renversée, l’oculaire, qui fournit une image virtuelle agrandie et droite

📐 Formule — Le grossissement total d’un microscope optique est égal au produit des grossissements de l’objectif et des oculaires : $G_{total}=G_{objectif}\times G_{oculaire}$.

💡 Astuce mémo

Source → condenseur → objectif → oculaire

📖 4. Fluorescence et fluorochromes

★ À maîtriser

• Un fluorochrome absorbe un photon incident, fait passer ses électrons à un état excité, puis émet lors de leur retour à l’état basal un photon de longueur d’onde supérieure.

📌 Les marqueurs fluorescents indiquent la présence d’une cible, tandis que les sondes fluorescentes indiquent une propriété de l’environnement ou deviennent fluorescentes après transformation enzymatique.

Compléments

📌 Le spectre d’excitation regroupe les longueurs d’onde capables d’exciter un fluorochrome, tandis que le spectre d’émission regroupe les longueurs d’onde des photons émis.

• La calcéine AM traverse la membrane des cellules vivantes, devient fluorescente après clivage enzymatique et reste piégée dans la cellule intacte, tandis qu’une cellule morte ou à membrane endommagée ne présente pas de fluorescence verte accumulée.

💡 Astuce mémo

Excitation du fluorochrome → émission d’un photon de plus grande longueur d’onde

📖 5. Microscopie confocale

★ À maîtriser

• La microscopie confocale utilise un laser, un pinhole et un balayage selon z pour recueillir des coupes optiques successives dont la superposition informatique permet une reconstruction tridimensionnelle.

Compléments

• Le pinhole élimine les rayons lumineux provenant des plans situés hors du plan focal observé et réduit ainsi le bruit de fond.

💡 Astuce mémo

Un pinceau laser balaie l’échantillon plan focal par plan focal

📖 6. Préparation des coupes histologiques

★ À maîtriser

• 🔄 Une préparation histologique classique comprend:
  1. la fixation
  2. l’inclusion
  3. la coupe
  4. la coloration
  5. le montage

📌 La fixation préserve les structures biologiques, maintient leur localisation spatiale et prévient l’autolyse en fournissant une image instantanée de l’échantillon.

• L’inclusion durcit l’échantillon en le déshydratant par des bains d’alcool croissants, en remplaçant l’alcool par du toluène puis en coulant de la paraffine fondue à 56 °C.

Compléments

• La congélation dans l’azote liquide à −196 °C, avec des agents cryoprotecteurs, préserve les acides nucléiques et l’activité enzymatique endogène de l’échantillon.

• Les coupes histologiques ont une épaisseur de 2 à 5 μm afin de permettre la traversée des photons, et elles sont réalisées au microtome ou au cryostat selon la méthode utilisée.

💡 Astuce mémo

Fixation → inclusion → coupe → coloration → montage

📖 7. Colorations histologiques

★ À maîtriser

📌 La coloration augmente le contraste des tissus naturellement incolores et nécessite un déparaffinage puis une réhydratation avant l’immersion dans les colorants.

Compléments

• La coloration HES associe: l’hématéine, qui colore les noyaux en violet, l’éosine, qui colore le cytoplasme en rose, le safran, qui colore les fibres de collagène en jaune-orangé

• Le trichrome de Masson associe: l’hématoxyline, qui colore les noyaux en brun, la fuchsine acide, qui colore le cytoplasme en rouge, le vert lumière ou le bleu d’aniline, qui colore les fibres de collagène en vert ou en bleu

💡 Astuce mémo

Hématéine colore le noyau, éosine le cytoplasme

📖 8. Immunohistochimie

🔑 Notions clés & Définitions

• Immunohistochimie : Détecte et localise un antigène grâce à un anticorps spécifique, puis révèle le complexe immun par une réaction enzymatique ou une fluorescence.

★ À maîtriser

• 🔄 La préparation immunohistochimique comprend: le déparaffinage et la réhydratation, le démasquage antigénique, le blocage des liaisons non spécifiques et des enzymes endogènes, l’incubation avec l’anticorps primaire, la détection directe ou indirecte, la contre-coloration et le montage

📌 La méthode directe couple directement l’anticorps primaire à une enzyme ou à un fluorochrome, tandis que la méthode indirecte utilise un anticorps secondaire marqué spécifique de l’anticorps primaire pour amplifier le signal.

Compléments

• Dans le cancer du sein, la détection de récepteurs aux œstrogènes oriente vers un traitement hormonal, tandis que la détection de la protéine HER2 oriente vers un traitement ciblé.

💡 Astuce mémo

Méthode directe : anticorps marqué ; méthode indirecte : anticorps secondaire amplificateur

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des microscopes

Colorations histologiques