Fiche de révision : Techniques d’analyse en oncogénétique

📋 Plan du Cours

1. Gènes, exons et variants
2. Choix des stratégies de séquençage
3. Étapes du séquençage par capture
4. Détection et analyse des variants
5. Classification des variants selon l’ACMG
6. Critères ACMG par type de données
7. Limites des lectures courtes
8. Long reads et séquençage de l’ARN
9. Validation ciblée et examens complémentaires

📖 1. Gènes, exons et variants

🔑 Notions clés & Définitions

• Exon : Séquence transcrite en ARNm.
• Variant : Séquence qui diffère de la séquence de référence.
• Exome : Ensemble des exons du génome.

★ À maîtriser

• Les principaux types de variants sont :
  • les substitutions
  • les insertions ou délétions
  • les réarrangements de grande taille

Compléments

📌 Un polymorphisme est présent dans plus de 1 % des allèles, tandis qu’un variant neutre est présent dans moins de 1 % des allèles.

📖 2. Choix des stratégies de séquençage

★ À maîtriser

📌 Le séquençage du génome cible l’ensemble du génome, avec une profondeur de 30×, tandis que le séquençage de l’exome cible les 23 000 gènes, avec une profondeur de 50× à 100×.

📌 Un panel ciblé analyse les gènes d’intérêt à une profondeur supérieure à 500× et constitue l’option la plus économique parmi les stratégies présentées.

Compléments

• Le séquençage du génome porte sur 3 000 000 000 bases, celui de l’exome sur 33 000 000 bases, et celui d’un panel sur 1 000 à 500 000 bases.

• La capture cible 70 gènes diagnostiques, leurs exons avec 50 nucléotides de part et d’autre, 16 SNP d’identitovigilance et des gènes étudiés en recherche.

💡 Astuce mémo

Génome entier : vaste et moins profond ; panel ciblé : restreint et très profond.

📖 3. Étapes du séquençage par capture

★ À maîtriser

• 🔄 Le processus comprend :
  1. l’enrichissement des séquences d’intérêt
  2. le séquençage
  3. l’analyse bio-informatique

Compléments

• En séquençage Illumina par synthèse, les fragments d’ADN reçoivent une séquence courte et unique, sont étalés sur une micropuce puis amplifiés, avant que des cycles de synthèse et d’enregistrement de fluorescence ne permettent leur lecture.

• En séquençage Illumina, un cycle ajoute des réactifs de synthèse et enregistre la fluorescence produite.

• La séquence d’une région est validée à partir de 30 lectures.

💡 Astuce mémo

Enrichir → séquencer → analyser.

📖 4. Détection et analyse des variants

★ À maîtriser

• L’analyse bio-informatique trie les séquences par patient, filtre les séquences de mauvaise qualité, aligne les séquences sur le génome de référence, annote les variants ponctuels, recherche les variants de nombre de copies et détecte les séquences chevauchant deux régions.

• Les cinq classes de variants sont :

  • neutre
  • probablement neutre
  • signification inconnue
  • probablement pathogène
  • pathogène

• La classification prend en compte : la fréquence dans une population non malade, l’association avec une maladie génétique, la perte ou le gain de fonction prédit, la perte ou le gain de fonction démontré, la compatibilité de la fonction du gène avec la maladie

Compléments

• La comparaison de génotypes par SNPxplex confronte un échantillon analysé par NGS à un échantillon analysé par PCR multiplexe.

📖 5. Classification des variants selon l’ACMG

★ À maîtriser

• Dans le système de points ACMG, PVS vaut 8 points, PS 4 points, PM 2 points, PP 1 point, BP −1 point, BS −4 points et BA −8 points. - American College of Medical Genetics

• Selon les seuils ACMG du cours, un score inférieur à −7 correspond à la classe 1 bénigne, un score de −1 à −6 à la classe 2 probablement bénigne, de 0 à 5 à la classe 3 de signification incertaine, de 6 à 9 à la classe 4 probablement pathogène, et supérieur à 10 à la classe 5 pathogène. - American College of Medical Genetics

Compléments

• PVS, PS, PM et PP désignent des arguments très fort, fort, moyen et faible en faveur de la pathogénicité, tandis que BA, BS et BP désignent des arguments suffisant, fort et faible en faveur du caractère bénin. - American College of Medical Genetics

• Les éléments ACMG peuvent inclure (American College of Medical Genetics) :

  • des données épidémiologiques
  • des données in silico protéiques
  • des données in silico d’épissage
  • des données fonctionnelles
  • des données de ségrégation familiale
  • des données de novo
  • des données alléliques
  • des données somatiques
  • des données additionnelles

• Le poids des éléments ACMG peut être modifié selon le contexte et l’avis des groupes d’experts. - American College of Medical Genetics

📖 6. Critères ACMG par type de données

★ À maîtriser

📌 PVS1 s’applique à un variant dont l’effet nul est prédit dans un gène où la perte de fonction est un mécanisme pathogène connu, en tenant compte de la position dans la protéine. - American College of Medical Genetics

Compléments

• Pour une pathologie à transmission dominante, BA1 s’applique lorsque la fréquence allélique gnomAD dépasse 1 %, et aussi lorsque la fréquence dépasse 0,1 % avec présence homozygote dans gnomAD. - American College of Medical Genetics

• PM2 peut être retenu lorsque la fréquence allélique est inférieure à 0,01 % ou lorsque le variant est absent des bases gnomAD. - American College of Medical Genetics

• PS4 s’applique lorsque la prévalence du variant chez les personnes atteintes est significativement supérieure à celle observée chez les contrôles. - American College of Medical Genetics

• PP3 peut être retenu lorsqu’un effet délétère d’un variant faux-sens est prédit par plusieurs logiciels, tandis que BP4 correspond à une prédiction bénigne par plusieurs logiciels. - American College of Medical Genetics

• BS3 correspond à des études fonctionnelles bien établies montrant un impact non délétère, tandis que PS3 correspond à des études bien établies montrant un impact délétère du variant. - American College of Medical Genetics

• PS2 correspond à un variant de novo avec confirmation de la paternité et de la maternité, tandis que PM6 concerne un variant de novo sans cette confirmation lorsque la pénétrance est considérée complète. - American College of Medical Genetics

📖 7. Limites des lectures courtes

★ À maîtriser

• Les limites des short reads concernent : les faibles mosaïques, les remaniements entre éléments répétés, les remaniements ou mutations loin dans les introns, les remaniements ou mutations dans les séquences régulatrices 5′, les variants dans des séquences similaires à des pseudogènes

Compléments

• Les anomalies difficiles à caractériser par short reads comprennent :
  • un exon cryptique
  • une inversion de grande taille
  • une insertion intronique
  • une séquence non unique de pseudogène

💡 Astuce mémo

Des séquences répétées ou très longues compliquent l’alignement → certains variants échappent aux short reads.

📖 8. Long reads et séquençage de l’ARN

★ À maîtriser

• La technologie Nanopore permet de lire l’ADN natif et l’ARN, de détecter la méthylation et d’obtenir des lectures de plus de 50 kb, mais son taux d’erreur est élevé.

• Le séquençage de l’ARN permet de : visualiser directement les anomalies d’épissage, détecter l’inclusion d’un exon cryptique, apprécier l’expression des deux allèles

Compléments

• Les remaniements difficiles à caractériser peuvent être étudiés en séquençant des fragments d’ADN de plus de 10 kb ou en séquençant l’ARN.

• Le séquençage de l’ARN dépend de l’expression du gène dans le prélèvement disponible et des transcrits alternatifs exprimés selon le tissu, et peut ne pas distinguer les deux allèles en l’absence de variant dans le transcrit.

💡 Astuce mémo

Les long reads éclairent les grands remaniements ; l’ARN révèle les anomalies d’épissage.

📖 9. Validation ciblée et examens complémentaires

★ À maîtriser

• Après la détection d’un variant d’intérêt, la démarche comprend sa vérification sur un prélèvement indépendant puis un séquençage ciblé.

• Le classement des variants est réalisé par deux personnes au laboratoire et doit être réévalué continuellement, notamment pour actualiser l’interprétation des variants de signification incertaine.

Compléments

• Les examens complémentaires mentionnés comprennent :
  • la QMPSF pour l’analyse quantitative
  • la RT-PCR pour l’analyse d’épissage
  • le caryotype
  • les essais fonctionnels

💡 Astuce mémo

Variant détecté → prélèvement indépendant → confirmation ciblée.

📊 Tableaux de synthèse

Stratégies de séquençage

Classes de variants et scores ACMG