Fiche de révision : Analyse du polymorphisme génétique

📋 Plan du Cours

1. Fondements de la biologie moléculaire
2. Génomique et étude des génomes
3. Principes du séquençage de l’ADN
4. Séquençage de Sanger, terminaison et séparation des fragments
5. Séquençage Illumina à haut débit
6. Séquençage de troisième génération
7. Détection de la méthylation de l’ADN
8. Assemblage des séquences génomiques
9. Métagénomique des écosystèmes
10. Annotation des gènes et transcrits
11. Prédiction des fonctions des protéines
12. Génomique comparée et évolution
13. Approches post-génomiques et systèmes
14. Analyses globales des données biologiques
15. Détection des mutations et polymorphismes, séquences répétées
16. Répétitions du génome humain
17. Identification et génotypage des SNP
18. Associations génétiques et diagnostic

📖 1. Fondements de la biologie moléculaire

★ À maîtriser

📌 Les généticiens recherchent les gènes en identifiant des mutations, les biochimistes purifient et caractérisent des molécules et les physiologistes étudient les réponses des systèmes et leurs régulations.

Compléments

• La biologie moléculaire est née dans les années 40 comme une approche intégrant génétique, biochimie et physiologie pour étudier le fonctionnement d’un organisme à partir de systèmes modèles simples, comme un bactériophage ou une bactérie.

📖 2. Génomique et étude des génomes

🔑 Notions clés & Définitions

• Génomique : Science qui étudie les génomes afin de comprendre leur formation, leur maintien et leurs fonctions.

📝 Points essentiels

• La génomique mobilise des approches allant du séquençage à l’identification des éléments des génomes, comme les gènes et les motifs, et à l’analyse de leur expression en ARN et en protéines.

📖 3. Principes du séquençage de l’ADN

★ À maîtriser

• La plupart des méthodes actuelles de séquençage génomique suivent l’addition séquentielle, par des polymérases, de bases marquées complémentaires à la matrice d’ADN.

• Les opérations unitaires des techniques de séquençage courantes ne lisent que quelques dizaines à quelques centaines de nucléotides, alors qu’un génome peut en compter plusieurs millions ou milliards.

• Le séquençage d’un génome repose sur le séquençage de fragments chevauchants, puis sur l’assemblage des séquences obtenues.

Compléments

📌 La méthode historique séquence des fragments clonés dans une banque génomique, tandis que les méthodes de deuxième génération séquencent directement des fragments isolés munis d’adaptateurs, sans étape de clonage.

📖 4. Séquençage de Sanger, terminaison et séparation des fragments

★ À maîtriser

• La méthode de Sanger, méthode prédominante depuis 1977 jusqu’à l’essor du séquençage à haut débit, est désormais réservée principalement au séquençage de fragments courts de quelques centaines à quelques milliers de paires de bases.

📌 Lorsqu’un ddNTP est incorporé, l’élongation ultérieure du brin d’ADN est impossible; avec le ddCTP, l’incorporation d’un dCTP permet au contraire à la synthèse de continuer.

• 🔄 La répétition de la méthode suit ces étapes. :

  1. Dénaturer les produits.
  2. Répéter l’élongation et la terminaison.
  3. Produire des simples brins arrêtés aléatoirement aux sites d’ajout des ddNTP.

• En séquençage de Sanger, les fragments d’ADN marqués sont séparés selon leur taille sur un gel de polyacrylamide, puis la séquence est déduite de l’ordre des bandes radioactives ou fluorescentes.

Compléments

• Dans la partie initiale de la méthode de Sanger, l’ADN est fragmenté aléatoirement et les fragments sont clonés séparément dans un vecteur pour constituer une banque.

• Pour chaque clone, un même oligonucléotide synthétique s’hybride sur une région du vecteur proche du site de clonage, avec son extrémité 3’OH orientée vers l’insert à séquencer.

• L’oligonucléotide est allongé par une ADN polymérase thermostable en présence des quatre dNTP et d’un seul des quatre didésoxynucléotides, présent en faible concentration.

• Dans le séquençage automatisé de Sanger, les produits de réactions différentes portent des fluorophores différents et peuvent être mélangés puis séparés sur une même piste, où chaque lettre est identifiée par la couleur émise.

• Une banque de fragments d’ADN peut être construite par fragmentation aléatoire, fractionnement selon la taille, clonage, établissement de lignées cellulaires, extraction de l’ADN plasmidique et séquençage des deux extrémités de l’insert.

• Le séquençage de Sanger du premier génome humain, qui comprend environ 3 milliards de nucléotides, a coûté plusieurs dizaines de millions de dollars et duré plusieurs années.

💡 Astuce mémo

L’incorporation d’un ddNTP bloque l’élongation de l’ADN.

📖 5. Séquençage Illumina à haut débit

★ À maîtriser

📌 Les méthodes de séquençage de deuxième génération, ou NGS, agissent sur des molécules isolées sans clonage, contrairement à la méthode de Sanger qui nécessite une banque de fragments clonés dans des plasmides et purifiés en grand nombre.

• La méthode Illumina consiste à fragmenter l’ADN, lier des adaptateurs synthétiques de séquence connue, dénaturer et fixer les simples brins sur une puce, les amplifier in situ en clusters, puis lire l’incorporation de nucléotides fluorescents par cycles de synthèse.

📌 Les lectures courtes et les séquences répétées compliquent l’assemblage de novo des génomes, tandis que le reséquençage aligne les séquences brutes sur un génome déjà assemblé de la même espèce.

Compléments

• Dans Illumina, chaque nucléotide incorporé porte un chromophore dont la fluorescence identifie la base, et son extrémité 3’-OH est chimiquement bloquée puis débloquée pour limiter l’incorporation à un nucléotide par cycle.

• Les méthodes Illumina permettent d’obtenir plusieurs gigabases de séquence brute en quelques jours.

• Le reséquençage par Illumina peut servir à analyser la diversité au sein d’une espèce ou, chez l’humain, la distribution des SNP et des marqueurs de prédisposition aux maladies.

💡 Astuce mémo

Fragmenter, adapter, fixer, clustériser, lire

📖 6. Séquençage de troisième génération

★ À maîtriser

📌 Les techniques de troisième génération séquencent de longues molécules uniques, contrairement aux techniques précédentes, et présentent un taux d’erreur de 5 à 20 %, contre moins de 1 % pour celles-ci.

• Les lectures des techniques de troisième génération mesurent quelques kilobases à quelques dizaines de kilobases, voire des centaines de kilobases.

• Le séquençage SMRT de PacBio suit des réactions de polymérisation isolées dans des microcellules ; les dNTP fluorescents libèrent leur fluorophore lors de leur incorporation, et la longueur d’onde émise identifie la base.

• La méthode MinION d’Oxford Nanopore fait passer l’ADN à travers une porine membranaire sous l’action d’un potentiel électrique, sa progression étant contrôlée par une protéine motrice ; les bases sont identifiées par la variation du courant ionique qu’elles provoquent en obstruant plus ou moins le pore.

Compléments

📌 Les longues lectures de troisième génération facilitent l’assemblage en réduisant la complexité du problème informatique et en dépassant souvent la longueur des séquences répétées.

• Les techniques SMRT de PacBio et MinION d’Oxford Nanopore permettent de détecter la méthylation de l’ADN.

💡 Astuce mémo

PacBio suit une polymérase ; MinION écoute un courant

📖 7. Détection de la méthylation de l’ADN

📝 Points essentiels

📌 Le séquençage SMRT détecte une base méthylée par l’allongement de la cinétique de réaction, tandis que MinION la détecte par une résistance électrique différente de celle d’une base non modifiée.

💡 Astuce mémo

SMRT : cinétique ralentie ; MinION : résistance modifiée

📖 8. Assemblage des séquences génomiques

★ À maîtriser

• Les assembleurs regroupent les séquences courtes aléatoires en contigs en recherchant leurs zones de recouvrement, puis les contigs liés forment des scaffolds.

• Les trous d’assemblage résultent de l’échantillonnage stochastique des molécules et de séquences répétées que l’assembleur ne peut pas discriminer.

• Le séquençage des deux extrémités d’un fragment long peut relier deux contigs, permettre leur juxtaposition et leur orientation, puis guider le séquençage exhaustif du fragment qui les sépare.

Compléments

• L’approche shotgun désigne l’assemblage automatisé des séquences de fragments aléatoires d’un génome et s’applique à tout type de projet de séquençage grâce aux progrès des assembleurs.

📌 Lorsque le trou d’assemblage n’est pas trop grand, sa séquence peut être déterminée après amplification par PCR.

📖 9. Métagénomique des écosystèmes

🔑 Notions clés & Définitions

• Métagénomique : Consiste à produire des contigs à partir de génomes mélangés extraits d’un biotope, chaque contig représentant une portion du génome d’un organisme présent dans l’écosystème.

★ À maîtriser

• L’annotation fonctionnelle des contigs métagénomiques peut révéler les fonctions importantes des organismes dans un biotope même sans reconstruction de leurs génomes.

Compléments

📌 Lorsque le mélange métagénomique contient peu d’organismes prédominants, il est possible d’espérer reconstruire in silico au moins certains des génomes qui le composent.

• Le phylogenetic binning identifie les contigs issus de différents génomes à partir de propriétés spécifiques de leur ADN, notamment le pourcentage de G+C et le profil des dinucléotides, afin de permettre une reconstruction, même partielle, des génomes constituants.

• Pour rechercher directement des fonctions dans un écosystème, l’ADN extrait peut être cloné dans des vecteurs d’expression, puis les clones exprimant les fonctions recherchées sont identifiés par criblage ou sélection si l’hôte exprime correctement l’information génétique étrangère.

📖 10. Annotation des gènes et transcrits

🔑 Notions clés & Définitions

• Phase ouverte de lecture : Une région située entre deux codons stop dans une phase de lecture et doit contenir un codon d’initiation pour pouvoir être traduite.

★ À maîtriser

• Une séquence possède six phases de lecture possibles, soit trois sur chacun des deux brins.

📌 Une ORF n’est pas équivalente à un gène : le gène comprend la séquence codant le produit protéique (CDS) ainsi que les signaux associés à la transcription.

• En RNA-seq, les ADNc produits à partir de l’ARNm extrait sont séquencés, les reads sont alignées sur la séquence chromosomique, et les régions correspondantes sont identifiées comme des exons ; le nombre de reads correspondants sert à mesurer l’intensité de transcription.

Compléments

• Les codons stop sont :

  • UAG
  • UGA
  • UAA

• Chez les bactéries et les archaea, les codons d’initiation sont AUG ou GUG, et moins fréquemment UUG, tandis que chez les eucaryotes, seul AUG est indiqué ; ces codons sont toujours traduits en méthionine.

• Un gène eucaryote contient typiquement des exons et des introns définis par des sites d’épissage, et ses exons terminaux peuvent inclure des régions non traduites impliquées dans la stabilité ou la régulation de la traduction de l’ARN.

• Le séquençage d’ADNc permet d’identifier les exons et les introns en comparant les séquences du transcrit et du génome, et fournit les séquences de la CDS ainsi que des régions 5’ et 3’.

📖 11. Prédiction des fonctions des protéines

🔑 Notions clés & Définitions

• Homologie de séquences : Relation d’ascendance commune entre deux séquences, qui est absolue : deux séquences sont homologues ou ne le sont pas.
• Identité de séquence : Proportion de nucléotides ou d’acides aminés identiques aux mêmes positions dans deux séquences alignées.
• Similitude de séquence : Présence, aux positions équivalentes, d’acides aminés appartenant à une même classe, par exemple chargés, polaires ou hydrophobes.

★ À maîtriser

• La fonction d’un CDS nouvellement identifié est prédite en comparant la séquence protéique déduite à des séquences de protéines connues, puis en évaluant les ressemblances et en proposant une fonction hypothétique.

Compléments

• Une forte identité suggère une relation d’homologie sans la démontrer formellement, et la conservation de séquence permet de proposer, sans certitude, une fonction biochimique ou structurelle aux protéines.

• Environ 20 % des séquences obtenues lors du séquençage systématique d’organismes modèles tels que Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae et Caenorhabditis elegans n’ont aucun équivalent connu.

💡 Astuce mémo

Homologie : ancêtre commun ; identité : positions identiques

📖 12. Génomique comparée et évolution

★ À maîtriser

• Le génome humain contient environ 25 000 gènes, soit à peine cinq fois plus qu’une bactérie comme Escherichia coli ou que la levure.

• Les séquences de protéines très conservées peuvent servir d’horloge moléculaire : le taux de substitution dans les régions traduites en protéines est à peu près proportionnel à l’ancienneté de la séparation des espèces.

• La génomique comparée combine notamment la présence ou l’absence de gènes, leur environnement génomique et la taille des familles de gènes pour établir des phylogénies, parfois différentes de celles admises auparavant.

Compléments

• En 1996, la séquence complète du génome de Saccharomyces cerevisiae a été obtenue à la suite d’un effort international auquel la CEE a joué un rôle de pionnier.

• Près de 30 % des gènes découverts lors du séquençage du génome de Saccharomyces cerevisiae ne ressemblaient à aucun gène connu.

• Une première ébauche de la séquence complète du génome humain a été proposée en 2000, puis une seconde en 2001.

💡 Astuce mémo

Comparaisons génomiques → phylogénies réévaluées

📖 13. Approches post-génomiques et systèmes

🔑 Notions clés & Définitions

• Transcriptome : Ensemble des éléments du génome dont on suit le niveau d’expression, notamment par hybridation sur puces à ADN ou par RNA-seq.
• Protéome : Ensemble des protéines dont on suit l’expression dans différentes conditions.
• Biologie des systèmes : Combinaison de données post-génomiques et d’analyses phénotypiques issues de mutants pour modéliser le fonctionnement global de la cellule comme un système intégré.
• Post-génomique : Ensemble de stratégies destinées à exploiter la masse d’informations produite par le séquençage des génomes.
• Interactome : Complexes protéiques stables ou transitoires qui se forment dans une condition donnée.
• Métabolome : Ensemble des métabolites suivis simultanément dans une population de cellules à l’équilibre afin d’obtenir une signature métabolique.

📝 Points essentiels

• La production d’un ARNm n’est pas équivalente à la production de la protéine correspondante.

📖 14. Analyses globales des données biologiques

★ À maîtriser

• Pour identifier une protéine séparée par électrophorèse en deux dimensions, on l’élue de la membrane, on la digère à la trypsine, on détermine par spectrométrie de masse les masses des peptides obtenus, puis on compare ces masses à celles prédites à partir du génome annoté.

• La biologie des systèmes cherche à intégrer dans des modèles les données de différents niveaux biologiques, comme les transcriptomes et les métabolomes, avec les données phénotypiques issues de mutants.

Compléments

• L’analyse RNA-seq représente le nombre de reads correspondant à chaque base le long d’une région du chromosome 2 de la drosophile, selon le stade de développement, et met en évidence les variations temporelles de transcription ainsi que les exons séparés par les introns éliminés lors de l’épissage.

📖 15. Détection des mutations et polymorphismes, séquences répétées

🔑 Notions clés & Définitions

• ADN satellite : Constitué de séquences de 10 pb à plus de 1000 pb répétées plusieurs milliers de fois à certains locus hétérochromatiques, notamment les centromères et les télomères, et séparable du reste de l’ADN par gradient de densité en raison de sa composition en bases.
• Minisatellites : Répétitions en tandem de courtes séquences de 5 à quelques dizaines de pb, souvent situées près des gènes dans des régions non codantes et présentes à de nombreux locus.
• Microsatellites : Répétitions en tandem de motifs de 2 à 4 pb, probablement générées par glissement et saut de la polymérase.
• SINE : Séquences dispersées de moins de 500 pb, présentes à environ 1,5 × 10⁶ exemplaires dans le génome humain et représentant environ 13 % de l’ADN total.
• LINE : Séquences dispersées de 5 à 7 kb à l’état complet, présentes à environ 8,5 × 10⁵ exemplaires dans le génome humain, dont beaucoup sont tronqués.

★ À maîtriser

• La mutation Glu6Val du gène de la chaîne β de la globine, à l’origine du variant HbS associé à l’anémie falciforme, détruit un site de restriction DdeI.

• Des oligonucléotides synthétiques de 19 bases reproduisant la séquence normale ou mutante permettent de détecter une mutation par un changement de température de fusion (Tm) lors de l’hybridation.

📌 Les sondes A et B révèlent directement la mutation, tandis que la sonde C détecte un polymorphisme situé sur le même chromosome et génétiquement lié à la mutation étudiée.

• Pour établir une empreinte génétique, on utilise comme sonde des minisatellites sur de l’ADN génomique digéré par une enzyme de restriction qui ne coupe pas dans les répétitions.

• Chez l’humain et les singes, les séquences Alu sont des SINE de 300 pb répétées environ 5 × 10⁵ fois, avec en moyenne une séquence tous les 5 à 6 kb.

Compléments

• La mutation Glu342Lys de l’α1-antitrypsine produit une protéine qui n’inhibe plus l’élastase pulmonaire et prédispose à l’emphysème pulmonaire.

• Pour le dépistage prénatal d’une mutation dans une famille à risque, on amplifie par PCR la région d’ADN porteuse de la mutation, puis on la détecte avec des sondes alléliques spécifiques après analyse de l’ADN de cellules amniotiques prélevées.

• Une sonde cDNA utilisée en Southern blot d’ADN génomique ou en Northern blot d’ARN totaux peut révéler une délétion totale ou partielle d’un gène, ou une anomalie de maturation ou de stabilité des ARNm.

• Dans l’espèce humaine, la fréquence moyenne de recombinaison est de 1 % entre des séquences séparées de 1000 kb, ce qui permet à des polymorphismes proches de ségréger comme des marqueurs très liés.

• La taille des minisatellites varie fréquemment d’un individu à l’autre et modifie la taille des fragments de restriction qui les portent.

• L’amplification d’un microsatellite de 3 pb dans une séquence codante ne change pas la phase de lecture, mais la répétition de l’acide aminé codé peut entraîner une pathologie.

💡 Astuce mémo

Les sondes A et B révèlent directement la mutation, tandis que la sonde C suit un marqueur lié.

📖 16. Répétitions du génome humain

📝 Points essentiels

• Les autres transposons du génome humain mesurent 100 pb à 3 kb et représentent 2 900 000 copies, soit 80 Mb et 3 % du génome ; les séquences répétées recensées totalisent 1 230 Mb, soit 41 % du génome.

📖 17. Identification et génotypage des SNP

🔑 Notions clés & Définitions

• SNP : Substitution de base présente chez au moins 1 % de la population humaine.

★ À maîtriser

• Le séquençage direct de la même région chez plusieurs individus permet de repérer les substitutions à chaque site, puis d’évaluer la fréquence des allèles dans la population.

• Le génotypage sur puce consiste à amplifier par PCR les régions susceptibles de contenir des SNP, à les marquer avec des nucléotides fluorescents, puis à les hybrider ensemble à la puce ; l’ADN s’apparie aux oligonucléotides correspondant à un ou aux deux allèles, révélant le profil allélique de l’individu.

Compléments

• Les SNP résultent de mutations ponctuelles qui ségrègent de façon mendélienne et touchent les gènes comme les régions intergéniques ; entre chromosomes homologues quelconques chez l’homme, on attend en moyenne 0,5 à 10 substitutions par kb, tandis que deux individus quelconques sont globalement identiques à 99,9 %.

• Le projet 1000 Genomes, lancé en 2007, a publié en 2015 une base libre d’accès sur la variation génétique de 2 504 individus issus de 26 populations et caractérisé plus de 88 millions de variants, dont 84,7 millions de SNP et 2,6 millions d’indels courts. - 1000 Genomes Project Consortium. Auton A, Brooks LD, Durbin RM, Garrison EP, A global reference for human genetic variation

• Une puce à ADN porte, à des positions définies, des oligonucléotides de 25 nucléotides ; pour chaque SNP analysé dans une population, deux à quatre oligonucléotides correspondant aux allèles connus sont greffés côte à côte, et plusieurs milliers de polymorphismes peuvent ainsi être analysés en une hybridation.

📖 18. Associations génétiques et diagnostic

★ À maîtriser

📌 Les SNP sont très rarement la mutation causant directement une maladie ; leur association statistique à un caractère peut plutôt signaler une région chromosomique ou un gène lié à ce caractère.

• L’identification d’une liaison génétique par SNP compare la distribution des SNP entre un groupe test et un groupe témoin ; des SNP qui coségrègent avec un caractère peuvent être génétiquement liés à un gène de susceptibilité.

Compléments

• L’association entre SNP et caractère repose sur l’hypothèse que des mutations délétères apparues dans un génome ancestral restent associées à une constellation de SNP plus anciens et spécifiques qui continuent à ségréger avec elles.

• Les porteurs d’un allèle particulier du gène de l’ACE sont décrits comme insensibles à l’énalapril, tandis que les porteurs d’un allèle d’un gène de cytochrome P450 métabolisent anormalement la débrisoquine et risquent un épisode d’hypotension.

• Le projet international HapMap, fondé sur l’analyse exhaustive de plusieurs millions de SNP chez 270 individus, a produit des cartes de SNP en 2005, 2007 et 2009, regroupant des SNP présents chez au moins 1 % de la population mondiale.

• Chez l’homme, 1 % de recombinaison correspond en moyenne à 1 Mb, et deux crossing-over sont en moyenne séparés par 50 Mb ; la fréquence de recombinaison varie fortement le long des chromosomes, et certains SNP sont inutilisables lorsqu’ils sont associés à un point chaud de recombinaison.

💡 Astuce mémo

Des SNP coségrégés orientent vers une région chromosomique associée au caractère

📊 Tableaux de synthèse

Détection en troisième génération

Séquences répétées dispersées