Fiche de révision : Appareillage et détecteurs en CLHP

📋 Plan du Cours

1. Principes et paramètres de rétention
2. Propriétés chimiques des analytes
3. Détection et dérivation des analytes
4. Sélection des solvants
5. Sélectivité des solvants
6. Réservoirs et pompes CLHP
7. Injection et haute pression
8. Colonnes et précolonnes
9. Choix et performances des détecteurs
10. Détection spectrophotométrique UV
11. Détection par fluorescence et dérivation
12. Détection réfractométrique
13. Diffusion de lumière et détecteurs spécialisés
14. Modes chromatographiques en CLHP
15. Chromatographie d’adsorption

📖 1. Principes et paramètres de rétention

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie liquide haute performance : Méthode de séparation fondée sur la distribution différente des espèces entre deux phases non miscibles, une phase stationnaire et une phase mobile.
• Sélectivité : Capacité d’un système chromatographique à séparer des molécules de structures proches.

★ À maîtriser

• La CLHP est la méthode chromatographique la plus utilisée dans le domaine du médicament et sert à déterminer la teneur d’une substance active ainsi que celle des impuretés.

• La rétention et la sélectivité dépendent de :

  • les propriétés du soluté
  • la nature de la phase stationnaire
  • la composition de la phase mobile
  • la température

Compléments

📌 Les analytes de masse inférieure à 2000 sont classés comme petites molécules, tandis que ceux de masse supérieure à 2000 sont classés comme grosses molécules, notamment les protéines et les peptides.

📌 Une substance active possède une activité, mais n’est pas nécessairement un principe actif ; un excipient sans activité n’est pas une substance active.

💡 Astuce mémo

Phase stationnaire et phase mobile : deux phases non miscibles, rôles distincts.

📖 2. Propriétés chimiques des analytes

🔑 Notions clés & Définitions

• Groupement ionisable : Un groupement ionisable présente un caractère acido-basique ; un groupement fort s’ionise totalement, tandis qu’un groupement faible ne transfère que partiellement son proton.

★ À maîtriser

• La solubilité dépend de la polarité du composé : les composés polaires sont solubles dans l’eau, les composés apolaires sont solubles dans l’hexane ou le dichlorométhane, les composés de polarité intermédiaire sont solubles dans le 2-propanol, mais insolubles dans l’eau et l’hexane

📌 Un composé polaire est retenu sur une phase stationnaire polaire, tandis qu’un composé apolaire est retenu sur une phase stationnaire apolaire.

Compléments

• Pour un acide faible à groupement carboxylique de pKa 5, à pH 2 le groupe est sous forme moléculaire COOH, tandis qu’à pH 7 il est sous forme anionique COO⁻.

📌 Une phase stationnaire apolaire retient la forme moléculaire COOH, mais pas la forme anionique COO⁻.

• Le pH et le pKa permettent de déterminer l’état de charge d’une molécule, qui peut être neutre, anionique ou cationique.

💡 Astuce mémo

COOH neutre est retenu, COO⁻ ne l’est pas sur une phase apolaire.

📖 3. Détection et dérivation des analytes

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromophore : Insaturation associée à l’absorption en spectrophotométrie UV-visible.
• Fluorophore : Un fluorophore est une structure chimique fluorescente dont le signal dépend notamment du pH, de la température, de la polarité du solvant et d’une éventuelle photodécomposition.
• Électrophore : Composé électroactif susceptible d’être oxydé ou réduit.

★ À maîtriser

• La dérivation modifie la structure d’un analyte dépourvu de groupement détectable en lui incorporant un groupe d’atomes permettant la détection souhaitée.

Compléments

• Les composés organiques détectables par voie électrochimique comprennent : les phénols, notamment les hydroquinones et les catéchols, les amines aromatiques, les thiols, les quinones, les composés nitrés, les sucres tels que les aminosides

📌 La dérivation nécessite un groupement fonctionnel réactif, par exemple un carboxyle, une amine primaire ou un thiol.

📌 Une dérivation lente se réalise avant la colonne, tandis qu’une dérivation rapide, comme celle utilisant l’OPA, peut se réaliser après la colonne ; la dérivation doit toujours précéder la détection.

• La tobramycine n’absorbe pas en UV en l’absence d’insaturations ; l’OPA peut lui ajouter des cycles aromatiques sur ses groupes amines afin de la rendre détectable en UV.

📖 4. Sélection des solvants

★ À maîtriser

• La sélection des solvants tient compte : d’une température d’ébullition supérieure d’au moins 20 à 50 °C à la température de séparation, de la miscibilité entre solvants et avec les échantillons, de la viscosité, de la compatibilité avec la détection, de la stabilité, de la toxicité, du coût

• Une viscosité plus élevée du solvant augmente la pression, réduit le débit et prolonge le temps de rétention.

Compléments

📌 Pour une détection UV, les solvants doivent être transparents à la longueur d’onde de travail afin que leur absorbance ne s’ajoute pas à celle du soluté.

📌 Avec une détection par spectrométrie de masse, la phase mobile doit être volatile, car le solvant est évaporé pour obtenir le signal du soluté.

• Le méthanol et l’acétonitrile sont les solvants les plus utilisés, et l’eau est le solvant le plus polaire.

💡 Astuce mémo

Solvant plus visqueux → pression accrue, débit réduit et rétention prolongée.

📖 5. Sélectivité des solvants

★ À maîtriser

• Un système de CLHP comprend quatre parties :
  • le pompage
  • l’injection
  • la séparation
  • la détection

Compléments

• Le triangle de sélectivité de Snyder classe les solvants selon trois grandeurs.

• Pour un mélange, choisir des solvants éloignés dans le triangle de sélectivité de Snyder permet de modifier les trois grandeurs en faisant varier les proportions d’une phase mobile binaire ou ternaire.

📖 6. Réservoirs et pompes CLHP

★ À maîtriser

📌 En élution isocratique, la composition de la phase mobile reste constante pendant l’analyse, tandis qu’en gradient elle varie afin de faciliter et d’accélérer la séparation.

Compléments

📌 Le réservoir de phase mobile doit être étanche pour éviter l’évaporation et la phase mobile doit être dégazée, car les gaz dissous, compressibles, perturbent le signal.

• Les pompes de CLHP peuvent être binaires, ternaires ou quaternaires.

📖 7. Injection et haute pression

★ À maîtriser

• Le débit d’une pompe de CLHP doit être précis et constant, entre 0,1 et 5 mL/min, et la pression admise peut atteindre 400 bar en haute performance.

📌 Les systèmes de très haute pression, jusqu’à 1200 bar, accélèrent la séparation sans nécessairement l’améliorer.

Compléments

📌 L’injection manuelle à la seringue utilise un volume calibré de 5 à 250 μL, tandis qu’un passeur automatique facilite les grandes séries, la réfrigération et le traitement des échantillons.

• La boucle d’injection à vanne six voies fixe le volume injecté, ce qui rend inutile l’étalonnage interne fondé sur une variation de volume.

📖 8. Colonnes et précolonnes

★ À maîtriser

• La précolonne protège la colonne des précipitations et peut servir à préconcentrer les échantillons.

Compléments

• Une colonne de CLHP mesure généralement 3 à 30 cm de long et 2,1 à 4,6 mm de diamètre interne.

📌 Thermostater la colonne, généralement autour de 40 °C et sans dépasser 60 °C, favorise l’efficacité et la reproductibilité des temps de rétention en limitant les variations liées à la température.

📖 9. Choix et performances des détecteurs

★ À maîtriser

• Un détecteur sert à visualiser la séparation et, selon le système, à quantifier ou identifier les analytes.

Compléments

• Le choix d’un détecteur dépend de :
  • son caractère universel ou spécifique
  • son domaine de linéarité
  • le bruit
  • la quantité minimale détectable
  • sa sensibilité
  • son caractère destructif

📖 10. Détection spectrophotométrique UV

★ À maîtriser

📐 Formule - La loi de Beer-Lambert s’écrit $A = \varepsilon_{\lambda} \cdot l \cdot C$, où ελ est le coefficient d’absorbance molaire.

📌 Un détecteur UV à longueur d’onde fixe mesure dans une plage déterminée, un détecteur programmable permet de choisir la longueur d’onde, et un détecteur à barrettes de diodes recueille simultanément les spectres sur un domaine défini.

Compléments

• Une cuve à circulation en Z de 8 à 12 μL augmente la longueur du trajet optique et donc l’absorbance et la sensibilité.

• La barrette de diodes fournit des données d’absorbance en fonction de la longueur d’onde et du temps, permettant une analyse à la fois quantitative et partiellement qualitative.

• La comparaison des spectres UV d’un pic avec celui d’un étalon aide à l’identifier et à évaluer sa pureté; des spectres sans pic spécifique peuvent révéler une coélution.

📖 11. Détection par fluorescence et dérivation

★ À maîtriser

• La détection spectrofluorimétrique mesure l’intensité de fluorescence et offre une grande sélectivité ainsi qu’une sensibilité pouvant atteindre 10⁻¹⁵.

📌 La dérivation précolonne prépare les dérivés avant l’injection mais présente des problèmes de reproductibilité et de sous-produits, tandis que la dérivation postcolonne intervient après la séparation mais peut disperser les bandes et exige une réaction rapide.

Compléments

• L’excitation par laser augmente la sensibilité de la détection par fluorescence.

📌 Les méthodes de détection directe sont préférées aux méthodes indirectes, car elles sont plus sensibles.

📖 12. Détection réfractométrique

🔑 Notions clés & Définitions

• Réfractométrie différentielle : La réfractométrie différentielle mesure la déviation d’un faisceau lumineux traversant une cellule échantillon et une cellule de référence, déviation proportionnelle à la variation relative de l’indice de réfraction.

★ À maîtriser

📌 La réfractométrie est peu utilisée en CLHP analytique en raison de sa faible sensibilité, mais elle est très utilisée en CLHP préparative.

Compléments

• La réfractométrie est universelle, peu sensible et sensible à la température ainsi qu’au gradient d’élution.

📖 13. Diffusion de lumière et détecteurs spécialisés

★ À maîtriser

• Le détecteur à diffusion de lumière est semi-universel : il convient aux solutés non volatils avec une phase mobile volatile, mais pas aux solutés volatils.

Compléments

• 🔄 Le détecteur à diffusion de lumière fonctionne en trois étapes :

  1. la phase mobile est nébulisée
  2. la phase mobile s’évapore dans un tube chauffé
  3. les solutés non volatils passent devant un faisceau lumineux

• La réponse du détecteur à diffusion de lumière dépend de la masse et de la concentration du soluté ainsi que de la population et de la taille des particules.

• Le détecteur à diffusion de lumière ne nécessite pas de chromophore et présente des difficultés avec les gradients, car son signal dépend de la phase mobile.

• La conductivité est utilisée notamment en chromatographie ionique pour détecter les ions minéraux.

• La spectrométrie de masse est présentée comme un détecteur universel, qualitatif et quantitatif.

📖 14. Modes chromatographiques en CLHP

★ À maîtriser

📌 Avant d’évaluer un échantillon, il faut vérifier la conformité du système aux critères spécifiés par la pharmacopée; si ces critères ne sont pas respectés, l’échantillon ne peut pas être évalué.

• Les quatre mécanismes de CLHP sont :
  • le partage
  • l’adsorption
  • l’échange d’ions
  • l’exclusion par filtration

Compléments

• La chromatographie de partage sépare selon la polarité des solutés répartis entre deux phases non miscibles.

• La chromatographie d’échange d’ions sépare selon l’ionisation des solutés au moyen d’une résine échangeuse d’ions.

• La chromatographie d’exclusion par filtration sépare notamment les grosses molécules, comme les protéines et les peptides, selon leur taille avec une phase stationnaire poreuse.

📖 15. Chromatographie d’adsorption

📝 Points essentiels

• La chromatographie d’adsorption emploie des phases stationnaires de gel de silice ou d’alumine, et la silice présente une surface spécifique de 200 à 600 m²/g.

📌 La silice est soluble à pH supérieur à 8.

• En chromatographie d’adsorption, l’hydratation de la surface empêche les molécules de soluté de s’y accrocher, ce qui impose de contrôler la teneur en eau de la phase mobile.