Fiche de révision : Biochimie structurale des protéines

📋 Plan du Cours

1. Eau et équilibres acide-base
2. Calculs de pH et tampons
3. Protonation et point isoélectrique
4. Acides aminés et chaînes latérales
5. Liaison peptidique et peptides
6. Séquençage et coupures protéolytiques
7. Structures et repliement des protéines
8. Séparation et analyse des protéines
9. Découvertes et repères historiques

📖 1. Eau et équilibres acide-base

🔑 Notions clés & Définitions

• Liaison hydrogène : Interaction faible entre un H δ⁺ et un O δ⁻ d’une autre molécule.
• Amphotérie de l’eau : L’eau est amphotère et appartient aux couples H₃O⁺/H₂O et H₂O/OH⁻.

★ À maîtriser

• La molécule d’eau est polaire, avec un angle H–O–H de 104,5°, un oxygène δ⁻ et des hydrogènes δ⁺.

📌 Un acide donne un proton H⁺, tandis qu’une base accepte un proton H⁺.

Compléments

• Les électronégativités sont :

  • O 3,44
  • N 3,04
  • C 2,55
  • H 2,20

• Un sel se dissout lorsque les dipôles de l’eau entourent ses ions, phénomène appelé hydratation ou solvatation.

• La solubilité d’un alcool diminue lorsque sa chaîne carbonée s’allonge.

• Un atome portant un doublet libre, comme O, N ou S, capte H⁺ et agit comme base, alors que l’eau joue alors le rôle d’acide.

• Une liaison ionisable O–H, N–H ou S–H peut céder H⁺ et agir comme acide, alors que l’eau joue alors le rôle de base.

💡 Astuce mémo

Un doublet capte H⁺ ; une liaison O–H, N–H ou S–H le cède.

📖 2. Calculs de pH et tampons

★ À maîtriser

📐 Formule - Pour un acide fort, $pH=-\log C$ ; pour une base forte, $pH=14+\log C$.

📐 Formule - Pour un acide faible, $pH=\frac{1}{2}(pK_a-\log C)$ ; pour une base faible, $pH=7+\frac{1}{2}(pK_a+\log C)$.

📐 Formule - Pour un tampon, l’équation de Henderson–Hasselbalch est $pH=pK_a+\log\left(\frac{[A^-]}{[AH]}\right)$.

📐 Formule - À l’équivalence d’un titrage, $n_{acide}=n_{base}$ et $C_aV_a=C_bV_{eq}$.

Compléments

📐 Formule - Les relations du cours sont $K_a=\frac{[H^+][A^-]}{[AH]}$, $pK_a=-\log K_a$, $K_a=10^{-pK_a}$ et $[H_3O^+]=10^{-pH}$.

📐 Formule - La concentration totale d’un couple acide-base est $C=[AH]+[A^-]$.

📌 Plus le pKa est élevé, plus l’acide est faible.

📌 Les formules des acides et bases forts sont indiquées comme valides pour C > 10⁻⁷ M, et celles des espèces faibles pour une concentration comprise entre 1 M et 10⁻⁶ M.

• Lors d’un titrage, le pKa est égal au pH à la demi-équivalence et le nombre de pKa correspond au nombre de plateaux, donc de groupements ionisables.

• Un tampon est efficace dans l’intervalle pKa ± 1 ; le PBS repose sur le couple H₂PO₄⁻/HPO₄²⁻ de pKa 6,82.

📖 3. Protonation et point isoélectrique

★ À maîtriser

• À pH ≤ pKa − 1, la forme AH représente environ 100 % (au moins 91 %) et la forme A⁻ est négligeable.

• À pH = pKa, les formes AH et A⁻ sont présentes chacune à 50 %.

• Le point isoélectrique est la moyenne des deux pKa qui encadrent l’espèce neutre, et non la moyenne de tous les pKa.

📌 Quand pH > pI, l’acide aminé porte une charge nette négative et migre vers l’anode (+) ; quand pH < pI, il porte une charge positive et migre vers la cathode (−) ; à pH = pI, il ne migre pas.

Compléments

• À pH = pKa − 0,5, les proportions sont environ ¾ de AH et ¼ de A⁻ ; à pH = pKa − 0,3, elles sont environ ⅔ de AH et ⅓ de A⁻.

• À pH 7, Asp et Glu ont une charge −1, Lys et Arg une charge +1, His environ +¼ et les autres acides aminés environ 0.

• Les pI fournis sont 5,6 pour les acides aminés sans R ionisable et Tyr, 5,15 pour Cys, 3,1 pour Asp, 3,25 pour Glu, 7,7 pour His, 9,7 pour Lys et 10,45 pour Arg.

• Pour Glu, la charge est +⅔ à pH 2, −½ à pH 4,2 et −1 à pH 7 ; pour Lys, elle est environ −¼ à pH 10.

💡 Astuce mémo

Au-dessus du pI, l’acide aminé va vers l’anode ; au-dessous, vers la cathode.

📖 4. Acides aminés et chaînes latérales

🔑 Notions clés & Définitions

• Squelette des acides aminés : Le squelette commun des acides aminés est ⁺H₃N–CαH(R)–COO⁻, sous forme zwitterionique.

★ À maîtriser

• Les acides aminés non polaires sont Gly (G, R = H, MM 75), Ala (A, CH₃, 89), Val (V, CH(CH₃)₂, 117), Leu (L, CH₂–CH(CH₃)₂, 131), Ile (I, CH(CH₃)–CH₂–CH₃, 131), Pro (P, cycle reliant Cα à N, 115), Phe (F, CH₂–phényle, 165), Met (M, CH₂–CH₂–S–CH₃, 149) et Trp (W, CH₂–indole, 204).

• Les acides aminés à fonction acide-base, avec leur pKa, charge à pH 7 et masse molaire, sont :

  • Asp (D, βCOOH, 3,9, anionique, 133)
  • Glu (E, γCOOH, 4,2, anionique, 147)
  • Lys (K, εNH₃⁺, 10,5, cationique, 147)
  • Arg (R, guanidinium, 12, cationique, 175)
  • His (H, imidazole, 6,5, neutre avec environ +¼, 155)
  • Cys (C, thiol, 8,0, neutre, 121)
  • Tyr (Y, phénol, 10,0, neutre, 181)

• Les pKa de référence sont :

  • αCOOH de tous les acides aminés : 2,3
  • βCOOH d’Asp : 3,9
  • γCOOH de Glu : 4,2
  • imidazole de His : 6,5
  • thiol de Cys : 8,0
  • αNH₃⁺ de tous les acides aminés : 8,9
  • phénol de Tyr : 10,0
  • εNH₃⁺ de Lys : 10,5
  • guanidinium d’Arg : 12

Compléments

• Les acides aminés polaires sans fonction acide-base sont :

  • Ser (S, CH₂–OH, 105)
  • Thr (T, CH(OH)–CH₃, 119)
  • Asn (N, CH₂–CO–NH₂, 132)
  • Gln (Q, CH₂–CH₂–CO–NH₂, 146)

• Phe, Tyr et Trp sont aromatiques et absorbent à 280 nm ; Cys et Met sont soufrés ; Ser, Thr et Tyr sont hydroxylés ; Asn et Gln sont amidés ; Lys, Arg et His sont basiques ; Asp et Glu sont acides.

• Leu et Ile sont des isomères, Pro est le seul acide aminé à amine secondaire, Cys forme les ponts disulfure et l’acide aminé extraterrestre du TD est l’isovaline, dont le Cα porte CH₃ et CH₂CH₃ mais pas d’hydrogène.

• Les masses atomiques en g/mol sont :

  • H 1
  • C 12
  • N 14
  • O 16
  • P 31
  • S 32

📖 5. Liaison peptidique et peptides

★ À maîtriser

• La liaison peptidique se forme par condensation entre –COOH et H₂N–, donnant –CO–NH– et H₂O ; il s’agit d’une liaison amide très stable.

• La liaison peptidique est plane et rigide en raison de la délocalisation électronique N–C=O ⇌ N⁺=C–O⁻, qui lui confère un caractère de double liaison partielle et place six atomes dans un même plan.

📌 Un peptide se lit du N-terminal portant NH₃⁺ libre vers le C-terminal portant COO⁻ libre, et Gly-Ala est différent de Ala-Gly.

📐 Formule - Pour un peptide de n acides aminés, le nombre de liaisons peptidiques et de molécules d’eau perdues est n − 1, et sa masse molaire est $\sum MM(aa)-(n-1)\times18$.

Compléments

• Les rotations du squelette sont possibles autour des liaisons Cα–N et Cα–C, décrites par les angles φ et ψ ; leurs combinaisons stables sont représentées par le diagramme de Ramachandran.

• Un dipeptide contient 2 résidus, un tripeptide 3, un oligopeptide 4 à 10 (ou 20), un polypeptide 10/20 à 50 et une protéine plus de 50 ; un résidu est un acide aminé intégré dans la chaîne.

• Les groupements ionisables d’un peptide sont le NH₃⁺ N-terminal, le COOH C-terminal et les chaînes latérales, car les groupements α internes sont engagés dans les liaisons peptidiques.

📌 Dans le nom d’un peptide, le suffixe -yl est ajouté à tous les acides aminés sauf au dernier, comme dans glycyl-alanyl-sérine pour Gly-Ala-Ser.

• Le glutathion est Glu-Cys-Gly et sa liaison Glu–Cys utilise le γCOOH, formant une liaison peptidoïde ; l’aspartame est Asp-Phe-OCH₃ et ne possède qu’une vraie liaison peptidique, avec une extrémité en ester méthylique.

📖 6. Séquençage et coupures protéolytiques

★ À maîtriser

• 🔄 Le séquençage d’Edman suit ces étapes :

  1. Le PITC se fixe sur le N-terminal.
  2. Un AZT-aa est formé puis transformé en PTH-aa.
  3. Le PTH-aa est identifié par HPLC.
  4. Le peptide raccourci d’un acide aminé recommence un cycle.

• Le séquençage de l’insuline par Sanger en 1955 a reposé sur la fragmentation et le recoupement de fragments chevauchants ; l’insuline comprend une chaîne A de 21 acides aminés et une chaîne B de 30, reliées par des ponts S–S.

Compléments

• Le BrCN coupe du côté C-terminal des résidus Met, NBS après Tyr et Trp, et l’hydroxylamine au niveau de la liaison Asn–Gly.

• La trypsine coupe après le carbone des résidus basiques Lys et Arg, tandis que la chymotrypsine coupe après le carbone des aromatiques Phe, Tyr et Trp et la pepsine avant l’azote des aromatiques Phe, Trp et Tyr.

• Asp-N protéase coupe avant l’azote d’Asp et des résidus de cystéine oxydés en acide cystéique, parfois Glu ; l’endoprotéase V8 coupe après le carbone de Glu, parfois Asp.

• L’aminopeptidase libère les acides aminés depuis le N-terminal ; les carboxypeptidases C et Y agissent depuis le C-terminal, Y pouvant libérer tous les acides aminés, y compris Gly, quoique lentement.

• La carboxypeptidase B libère Arg et Lys depuis le C-terminal ; les indications du CM attribuent à la carboxypeptidase A une coupure C-terminale concernant Arg, Lys et Pro, mais signalent que CPA ne coupe en réalité aucun de ces trois résidus.

📖 7. Structures et repliement des protéines

🔑 Notions clés & Définitions

• Domaine protéique : Portion de polypeptide autonome dans son repliement et dotée d’une fonction biochimique précise.

★ À maîtriser

📌 La structure primaire est la séquence d’acides aminés reliés par des liaisons peptidiques, tandis que la structure secondaire est le repliement local du squelette stabilisé par des liaisons H entre deux liaisons peptidiques différentes.

• L’hélice α est une hélice droite compacte de 3,6 résidus par tour et de pas 0,54 nm, stabilisée par des liaisons H entre les résidus n et n+4, avec les chaînes R vers l’extérieur.

• Le feuillet β est une structure étirée formée de brins parallèles ou antiparallèles, espacés de 0,335 nm entre résidus et stabilisés par des liaisons H entre brins voisins.

• La structure tertiaire est le repliement complet d’une chaîne, stabilisé par des interactions ioniques, des liaisons H, des interactions de van der Waals, des interactions hydrophobes et des ponts disulfure covalents ; son cœur est hydrophobe et sa surface hydrophile.

• La structure quaternaire est l’association de plusieurs chaînes ou sous-unités, comme l’hémoglobine α₂β₂ ; une protéine à chaîne unique comme Abl n’a pas de structure quaternaire.

Compléments

• Les boucles et coudes, dont le coude β, sont des portions peu structurées qui influencent taille, flexibilité, compacité et solubilité ; une superstructure secondaire est une association récurrente de structures secondaires adjacentes, comme le pli de Rossmann.

• Les classes de protéines et leurs exemples sont :

  • Globulaires : solubles, comme la myoglobine
  • Filamenteuses : insolubles, comme le collagène en triple hélice
  • Membranaires : porines en tonneau β et récepteurs à l’adrénaline en hélices α

• Dans la drépanocytose, une mutation faux sens Glu → Val sur la chaîne β produit HbS, qui forme des fibres et entraîne des globules rouges en forme de faucille.

• Le domaine SH3 reconnaît les polyprolines ; le domaine kinase fixe l’ATP et possède une activité enzymatique, comme dans Abl, dérégulée dans la leucémie myéloïde chronique.

📖 8. Séparation et analyse des protéines

★ À maîtriser

• La filtration sur gel sépare selon la taille et la forme avec des billes poreuses ; les grosses molécules sont éluées en premier dans le volume mort V₀, et la relation entre Ve et log MM est linéaire.

• L’échange d’ions sépare les protéines selon leur charge nette de surface : une résine cationique SO₃⁻ retient les cations et une résine anionique G⁺ retient les anions.

• En SDS-PAGE, le SDS confère une charge négative uniforme, le β-mercaptoéthanol casse les ponts S–S et la chaleur complète le traitement ; les protéines migrent de la cathode (−) vers l’anode (+), les petites parcourent une plus grande distance et la relation entre log MM et distance est linéaire.

Compléments

📐 Formule - En filtration sur gel, $V_r=débit\times t_r$.

• En échange d’ions, les protéines sont éluées en augmentant la force ionique avec KCl ou en changeant le pH, puis détectées à 280 nm pour les aromatiques ou à 214–215 nm pour les liaisons peptidiques.

• L’électrophorèse sur papier sépare selon la charge à un pH donné ; l’anode (+) attire les anions, la cathode (−) attire les cations et la ninhydrine révèle les acides aminés en violet.

• Plusieurs bandes en SDS-PAGE indiquent un échantillon non pur ; une protéine composée de n sous-unités identiques donne une bande à MM/n, comme la LDH de 140 kDa donnant une bande à 35 kDa.

📌 La filtration sur gel, la SDS-PAGE et la dialyse peuvent séparer selon la taille, tandis que l’échange d’ions sépare selon la charge et non selon la masse moléculaire.

💡 Astuce mémo

Le gel trie par taille ; l’échange d’ions trie par charge.

📖 9. Découvertes et repères historiques

★ À maîtriser

• En 1963, Anfinsen a montré que l’urée et le β-mercaptoéthanol dénaturent la ribonucléase et que leur retrait restaure son activité, soutenant l’hypothèse thermodynamique selon laquelle la séquence suffit à déterminer la structure 3D ; il a reçu le prix Nobel en 1972.

Compléments

• Sanger a séquencé l’insuline en 1955 et a reçu le prix Nobel en 1958 et en 1980.

• Pauling, Corey et Branson sont associés à l’hélice α ; seul Pauling a reçu le prix Nobel de chimie de 1954 ; des travaux antérieurs d’Astbury datent de 1930. - Pauling, Corey, Branson

• Kendrew a déterminé en 1958 la première structure 3D par cristallographie aux rayons X, celle de la myoglobine, et a reçu le prix Nobel en 1962 avec Perutz.

• Kauzmann a associé l’effet hydrophobe au repliement des protéines en 1959.