Fiche de révision : Chromatographie liquide haute performance

📋 Plan du Cours

1. Principes généraux de la CLHP
2. CLHP comparée à la CPG
3. Phase mobile et pompage
4. Injection et colonne
5. Phases stationnaires
6. Détection en CLHP
7. Optimisation de la séparation
8. Analyse quantitative et applications

📖 1. Principes généraux de la CLHP

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie liquide haute performance : Technique analytique générale dérivée de la chromatographie sur colonne dans laquelle la phase mobile est liquide et pompée sous pression à travers une phase stationnaire performante.

📝 Points essentiels

📌 En chromatographie sur colonne classique, la phase mobile s’écoule lentement par gravité, tandis qu’en CLHP elle est forcée sous pression par une pompe.

💡 Astuce mémo

CLHP : phase mobile pompée sous pression ; chromatographie classique : écoulement par gravité

📖 2. CLHP comparée à la CPG

★ À maîtriser

📌 La CLHP permet davantage de séparations difficiles que la CPG car les solutés interagissent avec la phase stationnaire et avec la phase mobile, tandis qu’en CPG ils interagissent principalement avec la phase stationnaire.

• Les coefficients de diffusion dans les liquides sont 10^4 à 10^5 fois plus faibles que dans les gaz, ce qui ralentit les échanges entre les phases et les séparations en CLHP.

📌 La CPG ne convient pas aux substances peu volatiles, notamment celles de masse molaire supérieure à 300 g·mol⁻¹, aux substances thermosensibles ni aux substances ionisées.

Compléments

• La CLHP permet d’utiliser des phases stationnaires variées, notamment pour l’échange d’ions et l’exclusion, qui sont impossibles en CPG.

💡 Astuce mémo

CLHP accepte les composés peu volatils et thermosensibles, contrairement à la CPG

📖 3. Phase mobile et pompage

★ À maîtriser

• La phase mobile est stockée dans un ou plusieurs réservoirs, puis filtrée et dégazée avant d’être pompée vers la colonne.

📌 L’élution isocratique utilise une phase mobile de composition constante, tandis que le gradient d’élution fait varier progressivement ou par paliers les proportions de solvants selon un programme établi.

• Les pompes de CLHP doivent fournir des pressions pouvant atteindre 420 bars, un débit compris entre 0,1 et 10 mL·min⁻¹ et une bonne résistance à la corrosion.

Compléments

📌 Un système isocratique peut fonctionner avec une seule pompe, tandis qu’un gradient de solvants nécessite soit une chambre de mélange basse pression, soit plusieurs pompes mélangeant les solvants sous haute pression.

💡 Astuce mémo

Réservoir → traitement → pompe → colonne

📖 4. Injection et colonne

★ À maîtriser

• Lors de l’injection, l’échantillon remplit la boucle à pression atmosphérique, puis la commutation de la vanne l’insère rapidement dans le flux de phase mobile sans interrompre la circulation.

• Le volume injecté en CLHP est généralement compris entre 5 et 500 μL, et vaut 30 μL sur l’appareil décrit.

• Une colonne de CLHP est un tube droit en acier de 3 à 25 cm de longueur et de 0,5 à 5 mm de diamètre intérieur, contenant une phase stationnaire maintenue entre deux disques poreux.

Compléments

• Les microcolonnes peuvent mesurer 5 cm de long et 0,3 mm de diamètre, avec un débit limité à quelques μL·min⁻¹, tout en consommant peu d’éluant et en offrant une meilleure résolution.

💡 Astuce mémo

Charger la boucle → commuter la vanne → injecter dans le flux

📖 5. Phases stationnaires

🔑 Notions clés & Définitions

• Gel de silice : Matériau de remplissage formé de microsphères très polaires de diamètre voisin de 2 à 5 μm, dont la séparation repose sur l’adsorption liée notamment aux groupements silanols.

★ À maîtriser

• Les silices greffées sont obtenues en fixant covalemment des molécules organiques sur les fonctions silanols afin de réduire et d’ajuster la polarité de la phase stationnaire.

📌 En phase normale, la phase stationnaire est polaire et la phase mobile est généralement peu polaire, tandis qu’en phase inverse la phase stationnaire est apolaire et la phase mobile généralement polaire.

Compléments

• Les principaux greffons de phase inverse sont:
  • C2 : diméthylsillyle
  • C8 : octylsillyle
  • C18 : octadécylsillyle
  • φ : phénylsillyle

💡 Astuce mémo

Phase normale : stationnaire polaire ; phase inverse : stationnaire apolaire

📖 6. Détection en CLHP

🔑 Notions clés & Définitions

• Détecteur : Fournit en continu un signal électrique reflétant les variations de composition de l’éluat à la sortie de la colonne.

★ À maîtriser

• Un bon détecteur doit:
  • Fournir une réponse proportionnelle à la concentration
  • Être sensible
  • Avoir une faible inertie et un faible volume mort
  • Être stable dans le temps
  • Présenter peu de bruit de fond

📌 Le détecteur UV mesure l’absorbance à une ou plusieurs longueurs d’onde, le détecteur à barrette de diodes fournissant en plus des informations spectrales utiles à l’identification.

Compléments

📌 Le détecteur réfractométrique mesure la différence d’indice de réfraction entre la phase mobile et l’effluent, mais il est peu sensible et inutilisable en gradient car la variation de composition provoque une dérive de la ligne de base.

💡 Astuce mémo

UV mesure l’absorbance, fluorescence mesure l’émission, réfractométrie mesure l’indice

📖 7. Optimisation de la séparation

★ À maîtriser

• L’optimisation d’une séparation en CLHP recherche un compromis entre une bonne résolution et un temps d’analyse court, en agissant notamment sur la colonne, la phase mobile, le débit et la température.

• Les critères de choix d’une colonne CLHP comprennent la phase stationnaire, la longueur L, le diamètre intérieur DI et le diamètre des particules dP.

📌 La composition, la polarité et le pH de la phase mobile, ainsi que le débit, influencent fortement l’efficacité de la séparation en CLHP.

Compléments

• Les chromatographes liquides modernes peuvent effectuer des séparations à plus de 120 °C si la phase stationnaire et les solutés résistent à cette température, ce qui peut réduire le temps d’analyse et améliorer la symétrie des pics.

💡 Astuce mémo

Choix colonne, éluant, débit et température → résolution accrue et analyse plus rapide

📖 8. Analyse quantitative et applications

🔑 Notions clés & Définitions

• Étalonnage externe : Détermine la masse ou la concentration d’un échantillon en reportant l’aire de son pic sur une courbe d’étalonnage aire = f(masse ou concentration), obtenue avec un volume injecté constant.
• Ajouts dosés : Consiste à ajouter à l’échantillon des quantités connues Δm du produit à analyser, puis à relier la variation d’aire ΔA à la quantité ajoutée en tenant compte d’une éventuelle dilution.

★ À maîtriser

📌 Une bonne séparation chromatographique se traduit par des pics distincts et reproductibles, et chaque analyse doit préciser la colonne, l’éluant, le débit, le mode de détection, la quantité injectée et les réglages pertinents.

• Un étalon interne doit être:

  • Pur et chimiquement inerte
  • Absent comme impureté dans l’échantillon
  • Séparé des autres constituants par son temps de rétention
  • Ajouté à une concentration donnant une aire comparable
  • Détecté de manière comparable au composé dosé

• La détermination de la pureté d’un produit brut de synthèse utilise généralement une CLHP de partage en phase inverse avec une silice greffée apolaire, un mélange acétonitrile-eau en mode isocratique, une détection UV à 254 nm et un dosage par étalon interne.

Compléments

📌 La normalisation interne est réservée aux mélanges dont tous les constituants sont identifiés par des pics séparés, le composé de référence étant lui-même présent dans le mélange à quantifier.

💡 Astuce mémo

Étalonner → injecter → mesurer l’aire → calculer la concentration

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison CLHP et CPG

Méthodes de quantification