Fiche de révision : Culture des cellules animales

📋 Plan du Cours

1. Cellules et dynamique des tissus
2. Définition et objectifs des cultures
3. Modèles in vitro et lignées cellulaires
4. Croissance des cellules en culture
5. Matériel et infrastructure de culture
6. Milieux de culture et facteurs de croissance
7. Supports de culture cellulaire
8. Conservation et congélation cellulaire
9. Contaminations cellulaires
10. Utilisation des cultures cellulaires

📖 1. Cellules et dynamique des tissus

🔑 Notions clés & Définitions

• Cellule : La plus petite unité vivante.
• Tissu : Un ensemble de cellules différenciées formant une association fonctionnelle et biologique.

★ À maîtriser

• L’approche méthodologique consiste à mettre en place des modèles d’étude in vitro par culture cellulaire, puis à compléter les résultats par une expérimentation in vivo.

Compléments

• Les quatre grandes familles de tissus sont :

  • les épithéliums
  • les tissus conjonctifs
  • les tissus musculaires
  • le tissu nerveux

• La durée de vie moyenne d’un entérocyte différencié est de 2 à 3 jours.

• Les tissus se renouvellent tout au long de la vie grâce aux cellules souches.

• L’expression de protéines spécifiques varie selon le stade de prolifération ou de différenciation cellulaire.

• L’OCDE définit les biotechnologies comme l’application de la science et de la technologie aux organismes vivants et à d’autres matériaux vivants ou non vivants pour produire des savoirs, des biens, des services et des agents d’intérêt.

💡 Astuce mémo

Altération des signaux → réponses cellulaires perturbées → pathologies

📖 2. Définition et objectifs des cultures

🔑 Notions clés & Définitions

• Culture cellulaire : Le maintien de cellules hors de l’organisme pendant plus de 24 heures dans des conditions permettant leur survie, leur prolifération et leur différenciation.

★ À maîtriser

• Les cultures cellulaires fournissent des modèles simplifiés pour étudier les fonctions fondamentales et les mécanismes d’action, avec des réponses rapides et relativement fiables et des résultats reproductibles lorsque les paramètres, comme le milieu, sont contrôlés.

Compléments

• Les objectifs thérapeutiques comprennent : la production d’anticorps et de protéines thérapeutiques, les essais de drogues, les études de pharmacologie des xénobiotiques, les études de toxicologie des xénobiotiques

• Les cultures cellulaires peuvent servir à la thérapie cellulaire avec des cellules souches ou d’autres cellules.

• Les cultures cellulaires sont relativement peu coûteuses et contribuent à utiliser moins d’animaux, ainsi qu’à évaluer les risques et les dommages.

📖 3. Modèles in vitro et lignées cellulaires

🔑 Notions clés & Définitions

• Culture primaire : La culture initiale de cellules venant d’être prélevées d’un tissu.
• Culture secondaire : La propagation d’une culture primaire et peut conduire à la création d’une lignée cellulaire.

★ À maîtriser

📌 Les coupes ou tranches d’organe conservent les structures et les fonctions, tandis que les cellules en suspension ou en monocouche conservent les fonctions d’origine ; ces modèles complémentaires réalisent in vitro des fonctions exprimées in vivo.

• La dissociation d’un prélèvement tissulaire peut être : mécanique, notamment au ciseau ou au scalpel stérile, enzymatique, avec une solution de collagénase, enzymatique, avec de la trypsine, enzymatique, avec de l’EDTA

📌 Une lignée immortelle a une durée de vie illimitée, tandis qu’une lignée transformée a une durée de vie illimitée et acquiert des propriétés de cellules malignes.

Compléments

• Les lignées cellulaires primaires ont une durée de vie limitée à environ 50 divisions ; les cultures peuvent être indifférenciées pendant 30 à 50 divisions.

• Les propriétés des lignées transformées comprennent :

  • l’autonomie de croissance
  • la perte de l’inhibition de contact
  • un besoin limité en facteurs de croissance
  • la formation de tumeurs chez la souris Nude

💡 Astuce mémo

Primaire : durée limitée ; transformée : prolifération illimitée

📖 4. Croissance des cellules en culture

★ À maîtriser

• La croissance cellulaire en culture comporte une phase de latence sans division, une phase exponentielle de division, une phase stationnaire liée à l’épuisement du milieu et à l’arrêt de la prolifération, puis une poursuite de la croissance après repiquage ou la mort cellulaire.

Compléments

• La durée de la phase de latence dépend du type cellulaire, du milieu de culture et de la densité cellulaire.

• Le temps de doublement pendant la phase exponentielle dépend du type cellulaire et varie de 4 à 48 heures.

💡 Astuce mémo

Latence → exponentielle → stationnaire → repiquage ou mort

📖 5. Matériel et infrastructure de culture

🔑 Notions clés & Définitions

• Poste de sécurité microbiologique : Une enceinte permettant de travailler stérilement, dont l’air est constamment filtré par des filtres absolus.

★ À maîtriser

• Le matériel de culture comprend : un espace stérile de travail avec un poste de sécurité microbiologique, un incubateur à atmosphère contrôlée, un microscope inversé à contraste de phase, du matériel de conservation, du matériel de stérilisation

• Les conditions d’incubation indiquées sont 37 °C, 5 % de CO₂ et une atmosphère humide.

Compléments

• L’incubateur contrôlé régule l’humidité, la température et le CO₂.

• Le matériel de conservation comprend :

  • un réfrigérateur
  • un congélateur à −20 °C
  • un congélateur à −80 °C
  • un conteneur d’azote liquide

• Le matériel de stérilisation comprend un four Pasteur et un autoclave.

• L’organisation de la salle de culture repose sur un environnement contrôlé avec filtres HEPA, sas et pressions variables d’une pièce à l’autre ; le niveau de confinement détermine les règles concernant notamment les déchets et les types de manipulations.

• Les conditions à reconstituer comprennent :

  • la température
  • le pH
  • le taux d’humidité
  • le milieu de culture

• La teneur en bicarbonate de sodium du milieu de culture est reliée au pourcentage de CO₂ de la phase gazeuse pour maintenir un pH neutre de 7,2.

📐 Formule - L’équilibre du système bicarbonate-dioxyde de carbone est $\mathrm{CO_2 + H_2O \rightleftharpoons HCO_3^- + H^+}$.

• Le microscope optique inversé à contraste de phase sert à observer les cellules en culture.

📖 6. Milieux de culture et facteurs de croissance

🔑 Notions clés & Définitions

• Facteurs de croissance : Protéines messagères impliquées dans le contrôle de la division, de la différenciation et de la survie cellulaires.

★ À maîtriser

• Les milieux de culture fournissent ions et sels minéraux, un tampon bicarbonate/CO₂, des acides aminés, des vitamines et une source de carbone comme le glucose; ils sont isotoniques, tamponnés, nutritifs et stériles.

📌 Le milieu de culture permet la survie à long terme et le maintien du métabolisme de base, tandis que l’ajout de sérum favorise la prolifération et/ou la différenciation cellulaire.

• Le sérum apporte des facteurs d’adhérence, des facteurs de croissance, des hormones, des facteurs de transport, du sélénium détoxifiant les ions superoxydes, des lipides, des métabolites, des éléments traces et un inhibiteur de trypsine (alpha2-macroglobuline).

Compléments

• Le DMEM est un milieu riche adapté à la majorité des cellules de mammifères.

• Ham’s F12 convient aux cellules CHO et est moins riche en Ca²⁺ que le DMEM.

• Le milieu 199 convient aux cellules rénales et aux fibroblastes embryonnaires, tandis que le RPMI convient aux cellules humaines tumorales et aux cellules sanguines.

• Le sérum de veau fœtal est le sérum le plus utilisé en culture cellulaire, tandis que le sérum de cheval est davantage utilisé pour la différenciation des cellules musculaires.

• Les principales familles de facteurs de croissance citées sont les PDGF, VEGF, EGF, TGF, FGF et les facteurs de la famille de l’insuline IGF-1 et IGF-2.

• Le passage du point de restriction du cycle cellulaire nécessite la présence de facteurs de croissance.

📖 7. Supports de culture cellulaire

★ À maîtriser

• Les supports de culture des cellules adhérentes comprennent :

  • Flacons de culture
  • Boîtes
  • Plaques multipuits
  • Tubes
  • Pipettes

• La culture 2D utilise un plastique chargé négativement comme support d’attache des cellules.

Compléments

• Les supports sont en polystyrène optiquement clair et stérile, peuvent être traités ou non pour l’adhérence et existent en contenances et surfaces variables, notamment 25, 75 et 150 cm².

• Les boîtes ont un diamètre de 35 à 150 mm, les plaques existent en formats de 6, 12, 24, 48 ou 96 puits, et les tubes peuvent notamment contenir 15 ou 50 ml.

• L’adhérence peut être améliorée par :

  • Collagène natif
  • Collagène dénaturé (gélatine)
  • Laminine
  • Fibronectine
  • Éléments matriciels laissés par d’autres cellules

• Des charges positives peuvent être apportées aux surfaces par la polylysine ou d’autres molécules chargées positivement, notamment pour les cellules nerveuses.

📖 8. Conservation et congélation cellulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Congélation cellulaire : Permet de conserver et de stocker des cellules à long terme.

★ À maîtriser

• Le choc thermique lors de la congélation, avec une température critique située entre 15 et 0 °C, provoque des effets mécaniques et des altérations différentielles des composants membranaires.

• Les effets du choc thermique sont réduits par :

  • Cryoprotecteurs, notamment le DMSO (5–10 %)
  • Certains phospholipides, notamment la PS
  • Refroidissement lent par paliers

Compléments

• L’évaluation après décongélation comprend :

  • Survie cellulaire au bleu trypan
  • Efficacité d’adhérence
  • Survie et capacité de croissance environ 24 h après décongélation

• Les températures de conservation indiquées sont −170 °C dans l’azote liquide, −80 °C dans une armoire HAIER et −150 °C dans une autre armoire HAIER.

📖 9. Contaminations cellulaires

★ À maîtriser

• Les contaminations comprennent :
  • Bactéries, dont les mycoplasmes
  • Virus
  • Levures
  • Champignons
  • Contaminations croisées par d’autres cellules

• Les mycoplasmes peuvent être détectés par coloration de leur ADN au DAPI ou au Hoechst suivie d’une observation microscopique, par détermination de l’activité enzymatique de l’adénosine phosphorylase ou par PCR avec une sonde spécifique.

• Les sources possibles de contamination sont :

  • Milieux et produits utilisés, notamment sérum et trypsine
  • Outils
  • Aérosols
  • Expérimentateur

• La prévention des contaminations repose sur :

  • Stérilisation du matériel
  • Stérilisation des milieux
  • Addition éventuelle de pénicilline/streptomycine dans le milieu
  • Bonnes pratiques gestuelles

Compléments

• Les contaminations peuvent réduire la croissance cellulaire par carence en acides aminés, inhiber la différenciation et détacher les cellules de leur support.

📖 10. Utilisation des cultures cellulaires

★ À maîtriser

• L’imagerie cellulaire en temps réel utilise une chambre thermostatée, humidifiée et à concentration en CO₂ contrôlée, montée sur la platine du microscope.

• Les types de cellules thérapeutiques cités comprennent :

  • Cellules sanguines : cellules souches hématopoïétiques, lymphocytes, mégacaryocytes et plaquettes
  • Cellules musculaires : myoblastes
  • Cellules épithéliales : peau et vaisseaux sanguins
  • Cellules souches adultes et embryonnaires

Compléments

• Les cultures cellulaires permettent d’étudier des modèles variés, notamment des cellules tumorales humaines du sein et du côlon.

• Un exemple d’imagerie en temps réel est le suivi pendant 12 h de la division et de la polyploïdisation de cellules mégakaryocytaires.

• Les travaux cités portent sur le traitement de :

  • Diabète
  • Maladie de Parkinson
  • Insuffisance cardiaque
  • Dystrophie musculaire
  • Cécité