QCM : Méthodes d’analyse du génome — 26 questions

Explication

La PCR réalise une réplication ciblée de l’ADN in vitro, alors que le clonage repose sur l’amplification dans une cellule hôte. La confusion vient du fait que les deux méthodes augmentent la quantité d’ADN, mais selon des contextes biologiques différents.

Explication

Kary Mullis, de la Cetus Corporation, a mis au point la PCR en 1985 et a reçu le prix Nobel de chimie en 1993. Ces deux dates correspondent à des événements distincts, et non à une seule date de développement.

Explication

La PCR peut produire environ un million de copies d’un fragment d’ADN en quelques heures. Une estimation de quelques centaines ou milliers sous-évalue fortement cette capacité d’amplification.

Explication

La Taq polymérase, extraite de Thermus aquaticus, est thermorésistante et possède une température optimale de polymérisation de 72 °C, tout en résistant aux étapes à 95 °C. La température de 95 °C sert principalement à dénaturer l’ADN, pas à optimiser la synthèse.

Explication

Un cycle commence par la séparation des brins lors de la dénaturation, suivie de la fixation des amorces, puis de l’élongation par la polymérase. L’hybridation ne sépare donc pas les brins : elle permet aux amorces de s’y fixer.

Explication

Les amorces sens et antisens encadrent la région à amplifier et offrent une extrémité 3’-OH à partir de laquelle la polymérase peut commencer la synthèse. Les dNTP, et non les amorces, sont les nucléotides incorporés pour former le nouveau brin.

Explication

Le mélange de PCR contient les dNTP, une polymérase thermostable, du MgCl2, un tampon, l’ADN matrice et deux amorces oligonucléotidiques. Les ribosomes, les lipides ou les anticorps ne constituent pas les réactifs fondamentaux de cette amplification.

Explication

Le modèle théorique prévoit un facteur d’amplification de $2^n$ après $n$ cycles ; pour 10 cycles, cela donne donc $2^{10}$ copies. Le rendement réel peut être inférieur à cette duplication idéale à chaque cycle.

Explication

La cinétique de la PCR commence par une phase de bruit de fond, suivie d’une amplification exponentielle, puis d’une phase linéaire et enfin d’un plateau. Le plateau correspond à la diminution de l’efficacité d’amplification lorsque la réaction progresse.

Explication

Le thermocycleur automatise les températures de dénaturation, d’hybridation et de synthèse, tandis que l’électrophorèse sur gel permet d’examiner la présence et la taille des produits. Le gel n’assure pas les étapes thermiques de la réaction et ne remplace pas le thermocycleur.

Explication

La RT-PCR commence par la conversion de l’ARN messager en ADN complémentaire, puis amplifie cet ADNc par PCR. La PCR classique, contrairement à la RT-PCR, utilise directement une matrice d’ADN.

Explication

L’ADNc possède le désoxyribose et la thymine caractéristiques de l’ADN, alors que l’ARN possède le ribose et l’uracile. La confusion fréquente consiste à attribuer à l’ADNc les constituants propres à l’ARN.

Explication

Le protocole prévoit un chauffage à 65 °C suivi d’un refroidissement rapide, puis l’ajout de la transcriptase inverse, des dNTP et du tampon avant l’incubation à 37–42 °C. Inverser ces températures modifierait l’ordre établi du processus.

Explication

La PCR en point final évalue l’ADN amplifié à la fin de la réaction, alors que la qPCR suit le signal fluorescent cycle après cycle. Ainsi, la qPCR permet une quantification plus informative que la simple observation finale.

Explication

Le Ct ou Cp correspond au nombre de cycles nécessaire pour que la fluorescence atteigne un seuil défini. Il ne désigne ni la concentration initiale ni la quantité finale d’amplicons.

Explication

La quantification absolue estime une concentration à partir d’une droite standard construite avec des concentrations connues. La quantification relative compare plutôt les Ct de différents échantillons.

Explication

Le SYBR Green est un agent intercalant qui devient fluorescent en présence d’ADN double brin, et l’intensité augmente avec le nombre d’amplicons. La séparation d’un reporter et d’un quencher décrit plutôt le fonctionnement d’une sonde TaqMan.

Explication

Avec le SYBR Green, la fluorescence peut provenir de tout ADN double brin, donc la courbe de fusion vérifie qu’un seul produit PCR a été obtenu. La séparation entre reporter et quencher concerne les sondes fluorescentes, pas le SYBR Green.

Explication

Pendant l’élongation, l’ADN polymérase hydrolyse la sonde hybridée et sépare le reporter du quencher, ce qui permet l’émission fluorescente. Le SYBR Green repose sur sa liaison à l’ADN double brin et ne met pas en jeu ce mécanisme de sonde.

Explication

Le multiplexage permet de suivre plusieurs cibles simultanément dans un même tube en utilisant des fluorochromes de spectres différents. La courbe de fusion concerne le contrôle de spécificité du SYBR Green, tandis que la droite standard relève de la quantification absolue.

Explication

Le séquençage détermine l’ordre des nucléotides dans une molécule d’ADN. Il ne permet pas, à lui seul, de déduire directement la fonction des gènes, qui constitue le distracteur le plus plausible.

Explication

Un ddNTP ne possède pas de groupement 3’-OH, indispensable à l’ajout du nucléotide suivant, ce qui arrête l’élongation. Le blocage de la fixation de l’ADN polymérase correspond à un mécanisme différent.

Explication

Les fragments sont séparés selon leur taille, puis leur ordre de migration est lu du bas vers le haut du gel pour reconstituer la séquence. Le regroupement par couleurs concerne plutôt les séquenceurs automatiques à plusieurs fluorochromes.

Explication

Le premier génome humain complet publié en 2008 a nécessité treize années de séquençage et un coût de trois milliards de dollars. La durée d’une dizaine d’heures et le coût d’environ mille euros correspondent aux capacités actuelles, et non à cette première réalisation.

Explication

Les NGS de deuxième génération suppriment le clonage mais nécessitent une fragmentation préalable du génome, alors que celles de troisième génération peuvent séquencer de longs fragments sans cette étape. L’inversion entre les deux générations constitue la confusion la plus plausible.

Explication

Les NGS génèrent un volume massif de données, dont l’analyse complète ne peut plus être réalisée manuellement. Elles produisent bien des séquences interprétables, tandis que la bio-informatique intervient surtout pour traiter et analyser ces résultats.