Fiche de révision : Méthodes d’analyse du génome

📋 Plan du Cours

1. Matériel biologique et lyse cellulaire
2. Séparation et purification nucléique
3. Fonctions générales des enzymes
4. Nucléases et modes de coupure
5. Enzymes de restriction et clonage
6. Modification des extrémités nucléiques
7. Polymérases et amplification
8. Électrophorèse et techniques blot

📖 1. Matériel biologique et lyse cellulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Homogénat : suspension cellulaire obtenue après la lyse des cellules

📝 Points essentiels

📌 Les tissus intacts représentent une source réaliste de cellules mais contiennent plusieurs types cellulaires, tandis que la culture cellulaire fournit une population plus homogène et moins variable, utilisable telle quelle.

• Le fractionnement cellulaire peut utiliser: le choc osmotique, les ultrasons, les méthodes mécaniques avec broyeur, chaleur et éventuellement microbilles

📌 Une lyse partielle rompt la membrane plasmique et les membranes du réticulum endoplasmique tout en conservant notamment le noyau et les mitochondries, tandis qu’une lyse énergique rompt toutes les membranes et libère l’ensemble des constituants cellulaires.

💡 Astuce mémo

Préparer → fractionner → libérer

📖 2. Séparation et purification nucléique

📝 Points essentiels

• L’ultracentrifugation préparative sépare les constituants de l’homogénat selon leur taille et leur densité, et plusieurs centrifugations peuvent être nécessaires pour obtenir une solution plus purifiée.

📌 L’ADN est généralement double brin, contient du désoxyribose et de la thymine, tandis que l’ARN est généralement monobrin, contient du ribose et de l’uracile.

• Après déprotéinisation par le β-mercaptoéthanol ou le SDS et précipitation des protéines par un mélange phénol-chloroforme, l’ADN est précipité par l’éthanol tandis que l’ARN est récupéré dans la phase aqueuse.

📌 Pour préserver l’ARN, il faut inhiber les RNases notamment avec l’isothiocyanate de guanidine, travailler à froid et en environnement stérile, puis effectuer rapidement l’extraction.

💡 Astuce mémo

ADN stable et précipitable, ARN fragile et aqueux

📖 3. Fonctions générales des enzymes

🔑 Notions clés & Définitions

• Enzyme : protéine qui joue le rôle de catalyseur biologique

📝 Points essentiels

• Les principales fonctions enzymatiques sont:
  • couper
  • méthyler
  • phosphoryler
  • déphosphoryler
  • ligaturer
  • polymériser

💡 Astuce mémo

Nucléases, méthylases, kinases, phosphatases, ligases, polymérases : couper, protéger, modifier, assembler, copier

📖 4. Nucléases et modes de coupure

🔑 Notions clés & Définitions

• Nucléases : hydrolases qui clivent les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides des acides nucléiques

★ À maîtriser

📌 Les exonucléases dégradent les acides nucléiques depuis une extrémité 5’ ou 3’ en libérant des mononucléotides, tandis que les endonucléases coupent à l’intérieur de la molécule en produisant des polynucléotides.

Compléments

• La nucléase S1 coupe aléatoirement les acides nucléiques simple brin et permet notamment d’analyser les hybrides ADN/ARN pour étudier l’organisation exon-intron des gènes.

• La DNAse I hydrolyse préférentiellement les liaisons phosphodiester situées au niveau des bases pyrimidiques de l’ADN simple ou double brin et sert notamment à éliminer l’ADN lorsqu’on travaille sur l’ARN.

💡 Astuce mémo

Exonucléase = extrémité ; endonucléase = intérieur

📖 5. Enzymes de restriction et clonage

🔑 Notions clés & Définitions

• Enzyme de restriction : endonucléase de haute spécificité qui coupe l’ADN double brin au niveau d’un site défini par une séquence nucléotidique déterminée

★ À maîtriser

📌 Une coupure à bout franc laisse deux extrémités nettes, tandis qu’une coupure à bout cohésif laisse des extrémités simple brin complémentaires, également appelées extrémités collantes ou protusives.

• Le clonage moléculaire consiste à insérer un fragment d’ADN appelé insert dans un vecteur de clonage approprié, tel qu’un plasmide bactérien, afin de créer ou d’exprimer un ADN recombinant.

Compléments

• Les enzymes de restriction reconnaissent le plus souvent des séquences palindromiques de 4 à 8 nucléotides, et certains sites de coupure sont situés à distance de la séquence reconnue.

💡 Astuce mémo

Des ciseaux moléculaires produisent des extrémités compatibles pour insérer un fragment dans un plasmide

📖 6. Modification des extrémités nucléiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Méthylase : ajoute spécifiquement un groupement méthyle —CH3 à une cytosine ou une adénine d’un site de restriction palindromique, ce qui empêche sa coupure par l’enzyme de restriction
• Polynucléotide kinase : ajoute un groupement phosphate fourni généralement par l’ATP à un polynucléotide
• Ligase : Une ligase reconstitue la liaison phosphodiester entre les extrémités 3’-OH et 5’-P de deux molécules d’ADN en consommant une molécule d’ATP par liaison formée.

★ À maîtriser

📌 Une phosphatase hydrolyse la liaison phosphoester d’une extrémité 5’ monophosphate d’un acide nucléique et libère un ion phosphate, ce qui empêche l’action des ligases.

Compléments

• La T4 kinase peut incorporer du phosphate radioactif 32P à l’extrémité 5’ hydroxyle d’ADN obtenu par PCR ou séquençage afin de faciliter sa détection.

💡 Astuce mémo

Kinase ajoute un phosphate, phosphatase l’enlève, ligase relie

📖 7. Polymérases et amplification

🔑 Notions clés & Définitions

• Polymérase : Une polymérase synthétise un acide nucléique par copie complémentaire et antiparallèle dans le sens 5’ vers 3’ à partir d’une amorce possédant une extrémité 3’-OH libre.

★ À maîtriser

📌 Une ADN polymérase ADN dépendante copie une matrice d’ADN en ADN, une ARN polymérase ADN dépendante copie une matrice d’ADN en ARN, et une ADN polymérase ARN dépendante copie une matrice d’ARN en ADN.

• La Taq polymérase, initialement extraite de Thermus aquaticus, est thermostable à 95 °C, s’active dès 65 °C et présente un optimum d’activité à 72 °C.

• La transcriptase inverse synthétise un ADN complémentaire appelé ADNc à partir d’un ARN simple brin et permet d’étudier l’expression des gènes lorsqu’elle est couplée à la PCR dans la RT-PCR.

Compléments

• L’ADN polymérase I d’Escherichia coli possède naturellement une activité polymérase 5’→3’, une activité exonucléase 5’→3’ et une activité exonucléase 3’→5’.

• Le fragment de Klenow est une ADN polymérase I privée de son activité exonucléase 5’→3’ et conserve les activités polymérase 5’→3’ et exonucléase 3’→5’.

💡 Astuce mémo

Matrice → amorce 3’-OH → copie complémentaire 5’→3’

📖 8. Électrophorèse et techniques blot

🔑 Notions clés & Définitions

• Électrophorèse en gel : L’électrophorèse en gel sépare les fragments d’acides nucléiques chargés négativement selon leur taille lorsqu’ils migrent dans un champ électrique à travers un gel.

★ À maîtriser

📌 Dans un gel, les fragments d’acides nucléiques les plus petits migrent plus rapidement et plus loin entre les pores, tandis que les fragments les plus longs sont davantage retardés.

• Le transfert de type blot consiste à réaliser une électrophorèse, transférer les acides nucléiques du gel vers une membrane par aspiration ou succion, puis les fixer sur cette membrane pour de nouvelles expériences.

📌 Le Southern-Blot concerne l’ADN, le Northern-Blot concerne l’ARN et le Western-Blot concerne les protéines.

Compléments

• La taille des pores du gel dépend de sa concentration et de sa réticulation, ce qui permet d’adapter la séparation à la taille des molécules d’ADN ou d’ARN.

📌 Une sonde chaude contient un radioélément tel que le phosphore 32, tandis qu’une sonde froide porte un marqueur non radioactif tel qu’un marqueur fluorescent.

📌 Une sonde liée à une haptène permet une révélation indirecte, car l’haptène est reconnu par un anticorps marqué fluorescent, radioactif ou coloré.

💡 Astuce mémo

Séparer sur gel → transférer sur membrane → révéler par sonde

📊 Tableaux de synthèse

Principales enzymes des acides nucléiques