Fiche de révision : Méthodes d’étude des protéines

📋 Plan du Cours

1. Structure et niveaux des protéines
2. Principes de l’électrophorèse
3. Migration selon la charge
4. Séparation selon la masse
5. Western blot et électrophorèse bidimensionnelle
6. Principes de chromatographie
7. Chromatographie sur couche mince
8. Localisation des protéines
9. Étudier la fonction des protéines

📖 1. Structure et niveaux des protéines

🔑 Notions clés & Définitions

• Structure primaire : Séquence en acides aminés, déterminée par la séquence du gène codant.
• Structure tertiaire : Repliement spatial de sa structure secondaire, faisant intervenir des interactions entre les radicaux des acides aminés.
• Structure quaternaire : Association de plusieurs sous-unités ayant chacune une structure tertiaire et interagissant par des interactions faibles et/ou des ponts disulfures.
• Structure secondaire : Premier niveau de repliement reposant sur des interactions entre les liaisons peptidiques, sans intervention des radicaux des acides aminés.

📝 Points essentiels

• Les protéines sont des assemblages d’acides aminés reliés par des liaisons peptidiques.

📖 2. Principes de l’électrophorèse

🔑 Notions clés & Définitions

• Électrophorèse : Méthode de fractionnement et d’analyse fondée sur la migration différentielle de particules chargées dans un champ électrique, selon leur charge et/ou leur taille.

★ À maîtriser

• 🔄 Une électrophorèse sur support se déroule en quatre étapes :
  1. Préparer le support poreux imbibé de solution conductrice et relié aux deux cuves
  2. Déposer les échantillons
  3. Appliquer un courant pour provoquer la migration
  4. Révéler les molécules

📐 Formule - À l’état stationnaire, la vitesse de migration vérifie $v=\\frac{QE}{6\\pi\\eta r}$ et la mobilité électrophorétique vérifie $\\mu=\\frac{v}{E}=\\frac{Q}{6\\pi\\eta r}$.

Compléments

• Un support solide d’électrophorèse doit être homogène, poreux et aussi inerte que possible ; il peut s’agir de papier, d’acétate de cellulose, de polyacrylamide ou d’agarose.

• Le champ électrique et la durée de migration déterminent la séparation obtenue par électrophorèse.

📐 Formule - La force électrique exercée sur une particule de charge $Q$ dans un champ électrique $E$ vaut $F=QE$.

💡 Astuce mémo

Préparer le support, déposer, faire migrer, révéler

📖 3. Migration selon la charge

🔑 Notions clés & Définitions

• Point isoélectrique : pH auquel sa charge globale est nulle et où elle ne migre pas dans un champ électrique.

★ À maîtriser

📌 Si le pH est supérieur au pHi, la molécule est globalement négative et migre vers l’anode ; si le pH est inférieur au pHi, elle est positive et migre vers la cathode ; si le pH égale le pHi, elle ne migre pas.

• Les fonctions ionisables d’une protéine comprennent :
  • L’extrémité N-terminale
  • L’extrémité C-terminale
  • Les radicaux d’Asp
  • Les radicaux de Glu
  • Les radicaux de Lys
  • Les radicaux d’Arg
  • Les radicaux d’His

Compléments

• Plus la différence absolue entre le pH du milieu et le pHi est grande, plus la charge de la molécule est importante.

📌 Une électrophorèse sur support à mailles lâches sépare les protéines selon leur charge, mais ne sépare pas des protéines de charges relatives identiques uniquement parce qu’elles diffèrent par leur taille.

• Les acides nucléiques ont une densité de charge uniforme : leur mobilité électrophorétique reste constante avec l’augmentation de leur taille.

💡 Astuce mémo

Au-dessus du pHi, anion vers l’anode ; en dessous, cation vers la cathode

📖 4. Séparation selon la masse

★ À maîtriser

• Dans un gel utilisé comme tamis moléculaire, les macromolécules les plus grosses migrent moins vite que les plus petites.

📌 L’électrophorèse native conserve la structure tridimensionnelle des protéines et renseigne peu sur leur taille, tandis que l’électrophorèse dénaturante modifie leur structure spatiale et peut séparer leurs sous-unités.

• Le SDS déplie les chaînes polypeptidiques en les enveloppant de charges négatives qui se repoussent, tandis que le β-mercaptoéthanol réduit les ponts disulfures intra- et inter-caténaires.

• En SDS-PAGE, les protéines dénaturées migrent du puits placé côté cathode vers l’anode, et les plus petites avancent plus vite dans le gel.

Compléments

• En PAGE, le polyacrylamide est formé par polymérisation de l’acrylamide et réticulation par le bis-acrylamide ; la taille des mailles dépend de leurs proportions.

• Le pourcentage d’agarose détermine le maillage du gel et son pouvoir de séparation ; les gels d’agarose sont horizontaux et solidifiés à partir d’une solution portée à ébullition.

• La masse moléculaire d’une protéine est estimée en faisant migrer des marqueurs de masses connues, en établissant la courbe d’étalonnage $\\log M=f(d)$, puis en utilisant la distance de migration de la protéine ; pour une bande épaisse, on mesure son front le plus éloigné du puits.

📖 5. Western blot et électrophorèse bidimensionnelle

🔑 Notions clés & Définitions

• Western blot : Transfert sur une membrane de protéines séparées selon leur masse par électrophorèse, puis détection à l’aide d’anticorps spécifiques.

★ À maîtriser

📌 Un témoin de charge permet une analyse semi-quantitative du western blot si les bandes du témoin sont équivalentes dans tous les puits ; l’intensité du marquage est alors proportionnelle à la quantité de protéines.

• L’électrophorèse bidimensionnelle sépare d’abord les protéines par pHi par focalisation isoélectrique dans un gradient de pH, puis, après rotation du gel à 90°, par masse en SDS-PAGE perpendiculairement à la première migration.

Compléments

• En western blot, les anticorps primaires reconnaissent la protéine recherchée, puis des anticorps secondaires liés aux premiers portent un marqueur fluorescent, radioactif ou enzymatique détectable.

• L’électrophorèse bidimensionnelle peut individualiser plusieurs centaines de protéines sur un gel de grande taille et produit des spots répartis selon leur masse moléculaire apparente et leur pHi.

📖 6. Principes de chromatographie

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie : Séparation des constituants d’un mélange par migration différentielle entre une phase mobile et une phase stationnaire, selon leur répartition entre ces deux phases.

★ À maîtriser

• La phase stationnaire retient les molécules tandis que la phase mobile les entraîne ; leur vitesse dépend notamment de leur solubilité, charge, polarité, taille, forme et sites particuliers.

• Les principales chromatographies selon leur mécanisme sont :
  • L’adsorption
  • L’affinité
  • L’échange d’ions
  • L’exclusion
  • Le partage

📌 La chromatographie d’échange d’ions retient les molécules selon leur charge, tandis que la chromatographie d’exclusion les sépare selon leur taille et leur forme.

Compléments

• La phase mobile chromatographique est un liquide ou un gaz, tandis que la phase stationnaire est un solide ou un liquide fixé.

• Les méthodes chromatographiques permettent de séparer des quantités de l’ordre du μg et peuvent servir à des analyses qualitatives et quantitatives.

• En chromatographie d’exclusion, les petites molécules sont retardées par leur passage dans les pores de la phase stationnaire, contrairement aux grosses molécules.

💡 Astuce mémo

Les affinités différentielles pour les phases fixe et mobile entraînent des vitesses de migration différentes

📖 7. Chromatographie sur couche mince

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie sur couche mince : Séparation de molécules sur une couche d’adsorbant étalée sur un support, où le solvant migre par capillarité.

• Rapport frontal : Le rapport frontal Rf caractérise la migration d’un soluté par rapport au front du solvant et est spécifique, à température donnée, d’un support et d’un solvant définis.

📝 Points essentiels

• En chromatographie sur couche mince, la cuve est saturée en vapeur de solvant afin de limiter l’évaporation de la phase mobile depuis la plaque.

• En chromatographie bidimensionnelle sur couche mince, une première migration est suivie d’une seconde migration perpendiculaire avec un autre système de solvants.

• Les spots incolores d’une chromatoplaque sont révélés par une réaction colorée, une fluorescence ou, après radiomarquage, une autoradiographie.

• L’analyse quantitative des spots peut se faire par :

  • Planimétrie
  • Élution suivie d’un dosage
  • Densitométrie
  • Mesure de la radioactivité

💡 Astuce mémo

Déposer, migrer, révéler, identifier

📖 8. Localisation des protéines

🔑 Notions clés & Définitions

• Immunomarquage : Localisation d’une protéine par reconnaissance spécifique d’une partie de celle-ci par des anticorps associés à un marqueur détectable.
• Gène rapporteur : Gène codant un produit observable en laboratoire, par exemple grâce à sa fluorescence ou à une activité enzymatique détectable, et permettant de visualiser ou mesurer l’expression d’un gène d’intérêt.

📝 Points essentiels

• Des anticorps secondaires reconnaissant les anticorps primaires peuvent augmenter la sensibilité et la visibilité de l’immunomarquage.

• Des anticorps couplés à des fluorochromes différents permettent, par superposition des images, de mettre en évidence une colocalisation possible de molécules.

• Un gène rapporteur peut être fusionné au gène étudié ou placé sous le contrôle de son promoteur afin de s’exprimer au même endroit que le gène d’intérêt.

📖 9. Étudier la fonction des protéines

🔑 Notions clés & Définitions

• Mutagenèse dirigée : Mutation localisée de l’ADN qui modifie une protéine en un site précis afin d’évaluer le rôle du résidu modifié dans une interaction, la forme, la localisation ou la fonction de la protéine.
• Transgenèse : Insertion d’un gène étranger dans un génome et expression de ce gène afin d’étudier les conséquences fonctionnelles de la protéine correspondante.

★ À maîtriser

📌 Si la modification d’un acide aminé entraîne de fortes conséquences structurales ou fonctionnelles, cet acide aminé est considéré comme particulièrement important pour la structure ou la fonction étudiée.

Compléments

• Une expérience de transgenèse peut réintroduire un gène préalablement invalidé par knock-out, ou conduire à la surexpression ou à la sous-expression d’un gène d’intérêt.

💡 Astuce mémo

Modifier un résidu ou l’expression du gène, puis observer les conséquences fonctionnelles