Fiche de révision : Méthodes et repliement des protéines

📋 Plan du Cours

1. Oses et nomenclature glucidique
2. Osides et glycosaminoglycanes
3. Glycoprotéines et glycosylation
4. Acides gras et lipides
5. Lipides membranaires et ancrage
6. Acides aminés et liaison peptidique
7. Structures secondaires des protéines
8. Structures tertiaires, quaternaires et méthodes
9. Électrophorèse et analyse protéique
10. Méthodes immunologiques et protéomiques
11. Principes du repliement protéique
12. Modèles et thermodynamique du repliement
13. Protéines chaperons et repliement assisté
14. Dégradation des protéines mal repliées
15. Rôle pathologique des protéines Hsp

📖 1. Oses et nomenclature glucidique

🔑 Notions clés & Définitions

• Isomères : Composés qui ont la même formule brute mais dont les molécules sont différentes.
• Épimères : Molécules qui ne diffèrent que par la configuration absolue d’un seul carbone asymétrique.

📝 Points essentiels

📌 Les stéréoisomères ont la même formule développée mais diffèrent par la position d’atomes ou de groupes d’atomes dans l’espace, tandis que les énantiomères sont des stéréoisomères images l’un de l’autre dans un miroir et non superposables.

• En solution, la fonction carbonyle réagit avec une fonction hydroxyle pour former un hémiacétal cyclique pouvant produire un cycle à six côtés appelé pyranose ou à cinq côtés appelé furanose.

💡 Astuce mémo

α et β s’opposent par la position du OH anomérique

📖 2. Osides et glycosaminoglycanes

🔑 Notions clés & Définitions

• Osides : Molécules dont l’hydrolyse fournit au moins deux molécules d’oses, identiques ou différents.
• Glycosaminoglycanes : Polysaccharides anioniques formés par la répétition d’unités disaccharidiques en chaînes linéaires généralement longues et constituant majeur de la matrice extracellulaire.

★ À maîtriser

📌 Un diholoside réducteur possède une liaison osido-ose laissant un OH hémiacétalique libre, tandis qu’un diholoside non réducteur possède une liaison osido-osidique impliquant les fonctions hémiacétaliques des deux oses.

Compléments

• À l’exception de l’acide hyaluronique, qui n’est pas lié covalemment à une protéine, les autres glycosaminoglycanes forment des protéoglycanes en étant liés à des protéines particulières.

💡 Astuce mémo

Hydrolyse des osides → oses seuls ou oses + aglycone

📖 3. Glycoprotéines et glycosylation

🔑 Notions clés & Définitions

• Glycoprotéines : Hétéroprotéines constituées d’une ou plusieurs chaînes d’acides aminés auxquelles sont greffés covalemment plusieurs oses ou dérivés d’oses.

★ À maîtriser

• 🔄 La N-glycosylation suit plusieurs étapes:
  1. Assemblage d’un précurseur sur le dolichol dans le réticulum endoplasmique
  2. Transfert en bloc du précurseur sur une asparagine
  3. Élimination du glucose
  4. Remaniements dans l’appareil de Golgi

Compléments

• Lors de la O-glycosylation, les oses sont ajoutés un à un sur la protéine dans l’appareil de Golgi, en commençant par la N-acétylgalactosamine.

💡 Astuce mémo

N-glycosylation : dolichol → asparagine → élimination du glucose → Golgi

📖 4. Acides gras et lipides

🔑 Notions clés & Définitions

• Acides gras : Possèdent une fonction carboxyle et une longue chaîne carbonée de 4 à 24 carbones, généralement en nombre pair, et circulent surtout sous forme estérifiée.

★ À maîtriser

📌 Un acide gras saturé ne possède pas de double liaison, tandis qu’un acide gras insaturé en possède au moins une.

• Les acides gras saturés ont un rôle énergétique fournissant 9 kCal par gramme.

Compléments

• Les principaux acides gras saturés cités sont:
  • L’acide butyrique à 4 carbones
  • L’acide palmitique à 16 carbones
  • L’acide stéarique à 18 carbones

💡 Astuce mémo

Saturé sans double liaison, insaturé avec double liaison

📖 5. Lipides membranaires et ancrage

🔑 Notions clés & Définitions

• Glycérophospholipides : Constituants majeurs des membranes biologiques formés d’un glycérol, de deux acides gras, d’un phosphate et d’un alcool, avec un pôle hydrophobe et un pôle hydrophile.

★ À maîtriser

• La sphingomyéline représente 30 % des membranes plasmiques, constitue un élément essentiel de la gaine de myéline et rigidifie les membranes en présence de cholestérol.

Compléments

• Les phosphatidylsérines et les phosphatidylinositols sont des phospholipides des feuillets internes des membranes et portent une charge globale négative.

• La glypiation relie par une liaison amide le carboxyle de l’acide aminé C-terminal d’une protéine ectoplasmique à la fonction amine de la phosphoéthanolamine d’un glycosylphosphatidylinositol.

📖 6. Acides aminés et liaison peptidique

🔑 Notions clés & Définitions

• Point isoélectrique : pH auquel un acide aminé possède une charge nette neutre sous forme zwitterionique.
• Liaison peptidique : Liaison amide particulière, plane, rigide et polaire, présentant un caractère de double liaison partielle par résonance.

📝 Points essentiels

• Dix-neuf des vingt acides aminés sont optiquement actifs, la glycine faisant exception, et seule la forme L est retrouvée dans les protéines.

• Les acides aminés basiques ont des points isoélectriques élevés, comme la lysine à 9,47, tandis que les acides aminés acides ont des points isoélectriques bas, comme l’acide aspartique à 2,98.

💡 Astuce mémo

CORN : CO-R-N dans le sens horaire pour la configuration L

📖 7. Structures secondaires des protéines

🔑 Notions clés & Définitions

• Structure secondaire : Organisation périodique ou régulière de segments de la chaîne polypeptidique en une structure tridimensionnelle locale stabilisée notamment par des interactions locales et des liaisons hydrogène.

📝 Points essentiels

• Les trois grands types de structures secondaires sont:

  • L’hélice alpha
  • Le feuillet bêta
  • Les brins ou boucles

• Dans une hélice alpha, une liaison hydrogène intrachaîne s’établit entre l’oxygène carbonylé d’un acide aminé n et l’hydrogène amide de l’acide aminé n+4.

• Les brins bêta peuvent être parallèles ou antiparallèles, et les chaînes latérales de deux acides aminés adjacents pointent dans des directions opposées.

💡 Astuce mémo

Hélice α → feuillet β → coudes et boucles

📖 8. Structures tertiaires, quaternaires et méthodes

🔑 Notions clés & Définitions

• Domaine protéique : Région compacte d’environ 30 à 500 acides aminés, adoptant une structure indépendante et pouvant posséder une fonction propre.
• Structure quaternaire : Association spécifique de plusieurs chaînes polypeptidiques identiques ou différentes par des liaisons faibles non covalentes ou covalentes.

📝 Points essentiels

• La structure quaternaire permet notamment la régulation allostérique, la coopérativité et une architecture adaptée des complexes protéiques.

• La spectrométrie de masse produit des ions en phase gazeuse, les sépare selon leur rapport masse/charge, puis convertit leur détection en un signal analysable.

📌 La SDS-PAGE sépare les protéines totales selon leur masse moléculaire, tandis que le Western blot détecte une protéine spécifique grâce à des anticorps.

💡 Astuce mémo

Séparer → identifier → quantifier

📖 9. Électrophorèse et analyse protéique

🔑 Notions clés & Définitions

• Électrophorèse : Séparation des molécules selon leur masse moléculaire et leur charge dans un support soumis à un champ électrique.

★ À maîtriser

📌 En conditions natives, les protéines migrent selon leur charge, leur masse moléculaire et leur forme, tandis qu’en conditions dénaturantes le SDS les linéarise et leur confère une charge uniforme afin que la migration dépende principalement de leur masse moléculaire.

• 🔄 La préparation d’une SDS-PAGE comprend: l’extraction des protéines, l’ajout de SDS et d’un agent réducteur comme le DTT ou le β-mercaptoéthanol, le chauffage à 100 °C, la migration sur gel sous champ électrique

Compléments

• Un marqueur de charge est une protéine présente en quantité constante et connue qui permet de vérifier la qualité et la reproductibilité du dépôt.

💡 Astuce mémo

Séparer → transférer → révéler

📖 10. Méthodes immunologiques et protéomiques

🔑 Notions clés & Définitions

• ELISA : Méthode quantitative, sensible et spécifique réalisée avec deux anticorps reconnaissant deux épitopes différents d’une protéine, notamment dans le sang, le liquide céphalo-rachidien ou l’urine.
• Cytométrie en flux : Compte les cellules fluorescentes, mesure le pourcentage de cellules positives et quantifie l’intensité de fluorescence corrélée au niveau d’expression protéique.

★ À maîtriser

• 🔄 L’immunoprécipitation consiste à: lyser les cellules, ajouter un anticorps spécifique et des billes affines, centrifuger, laver, décrocher le complexe par élution

• Si la protéine B est détectée après purification de la protéine A par immunoprécipitation, les deux protéines sont considérées comme physiquement en interaction.

• 🔄 L’identification protéomique historique comprend: la séparation électrophorétique, l’isolement d’un spot, la digestion par la trypsine, l’analyse des peptides par spectrométrie de masse, la comparaison avec des bases de données

Compléments

• Les méthodes d’étude des protéines reposent principalement sur leurs propriétés physico-chimiques ou sur les réactions antigène-anticorps et sont utilisées en recherche comme en biologie médicale courante.

💡 Astuce mémo

Protéine ciblée par anticorps, mélange analysé par spectrométrie

📖 11. Principes du repliement protéique

🔑 Notions clés & Définitions

• Repliement protéique : Christian B. Anfinsen, 1961 — Processus physique par lequel une protéine adopte une structure tridimensionnelle appelée conformation native, qui lui confère sa fonction biologique.

★ À maîtriser

• Selon la théorie d’Anfinsen, la structure primaire conditionne essentiellement le chemin le plus probable vers la structure fonctionnelle native. — Christian B. Anfinsen, Principles that govern the folding of proteins chains, 1973

• La stabilisation implique:

  • des liaisons hydrogène
  • des liaisons ioniques ou ponts salins
  • des interactions électrostatiques
  • des forces de van der Waals
  • des ponts disulfure
  • l’effet hydrophobe

Compléments

• L’effet hydrophobe rassemble les résidus hydrophobes dans des régions internes, réduit les surfaces de contact entre l’eau et ces zones et augmente l’entropie de l’eau libérée.

💡 Astuce mémo

Séquence primaire → interactions → conformation native

📖 12. Modèles et thermodynamique du repliement

🔑 Notions clés & Définitions

• Entonnoir de repliement : Peter Wolynes — Représentation de l’organisation progressive de structures partiellement repliées selon de multiples chemins, avec diminution du nombre de conformations et convergence vers des états énergétiquement favorables.

★ À maîtriser

• Le repliement protéique est spontané et dépend de la protéine et de son environnement, mais un repliement réalisé au hasard prendrait environ 10^11 années, ce qui constitue le paradoxe de Levinthal.

• 🔄 Le modèle séquentiel et hiérarchique comprend (Ptitsyn/Balwin, 1973-1975): la nucléation, la formation rapide de structures secondaires, la formation de structures super-secondaires et de domaines

Compléments

• Le modèle de diffusion-collision décrit des structures secondaires transitoires qui diffusent et s’entrechoquent, forment des intermédiaires stables par interactions hydrophobes, puis s’assemblent en structure native. — Karplus et Weaver, 1994

💡 Astuce mémo

Un entonnoir énergétique guide les conformations vers l’état natif

📖 13. Protéines chaperons et repliement assisté

🔑 Notions clés & Définitions

• Protéines chaperons : Yon, 1997 — Empêchent l’agrégation des chaînes mal repliées et leur donnent une nouvelle possibilité d’atteindre la conformation native.

★ À maîtriser

📌 Le système Hsp70 ou DnaK assure le repliement, le transport membranaire, la réactivation des protéines endommagées et la prévention de l’agrégation, tandis que le système GroEL-GroES ou TRiC/CCT agit comme une chaperonine de repliement dépendante de l’ATP.

• Chez les bactéries:

  • 70 % des chaînes se replient rapidement sans aide
  • 20 % des chaînes longues impliquent DnaJ-DnaK
  • 10 % des chaînes impliquent GroEL-GroES

• 🔄 Dans le cycle DnaK:

  1. Hsp40 se lie à la protéine mal repliée
  2. Hsp40 stimule l’hydrolyse de l’ATP de Hsp70
  3. NEF échange l’ADP contre de l’ATP
  4. Hsp70 est libérée pour un nouveau cycle ou un transfert

Compléments

• Les principales classes de protéines Hsp sont:
  • Hsp100 supérieure à 100 kDa
  • Hsp90 de 81 à 99 kDa
  • Hsp70 de 65 à 80 kDa
  • Hsp60 de 55 à 64 kDa
  • Hsp40 de 35 à 54 kDa
  • les petites Hsp inférieures à 35 kDa

💡 Astuce mémo

Hsp40 → Hsp70 → échange ATP/ADP → nouveau cycle

📖 14. Dégradation des protéines mal repliées

🔑 Notions clés & Définitions

• Dénaturation protéique : Modification réversible ou irréversible de la conformation native sans rupture des liaisons covalentes, à l’exception possible des ponts disulfure, et sans modification de la structure primaire.
• ERAD : Voie cellulaire qui cible les protéines mal repliées du réticulum endoplasmique pour leur ubiquitination, leur rétrotranslocation vers le cytoplasme et leur dégradation ultérieure par le protéasome.

★ À maîtriser

• La voie cytosolique de couplage chaperons-protéasome reconnaît les protéines exposant des résidus hydrophobes avec le complexe BAG6, les ubiquitine par la ligase E3 RNF126, puis les adresse au protéasome 26S.

• L’ubiquitination active l’ubiquitine par E1 en présence d’ATP, la transfère à E2, puis E3 reconnaît la protéine mal repliée et transfère l’ubiquitine sur la cible, avec formation possible d’une chaîne polyubiquitine. — Ciechanover, Hershko et Rose, 2004

Compléments

• La dénaturation peut être induite par:

  • la chaleur
  • des pH extrêmes
  • les rayons ultraviolets
  • les rayons X
  • une forte concentration saline
  • une baisse de la concentration en oxygène
  • des agents chaotropes et des détergents
  • des mutations somatiques

• Dans le réticulum endoplasmique, la protéine disulfure isomérase forme et réarrange les ponts disulfure, tandis que la peptidyl-prolyl isomérase convertit les liaisons peptidiques impliquant une proline.

💡 Astuce mémo

Reconnaître → ubiquitiner → rétrotransloquer → protéasome

📖 15. Rôle pathologique des protéines Hsp

★ À maîtriser

• Hsp70 est exprimée constitutivement à bas niveau, est induite par les stress, est abondante dans certaines cellules cancéreuses et peut favoriser la tumorigenèse ainsi que la formation de métastases.

Compléments

• Hsp70 possède une fonction anti-apoptotique et peut contribuer à l’échappement à la surveillance immune par la production d’IL-10 et l’immunosuppression. — Liu et al., Hsp 70 in human diseases and disorders, 2018

• Des inhibiteurs d’Hsp70 ou d’Hsp90, notamment l’apoptozole, la geldanamycine, le pifithrin-μ, le panaxynol et la platycodine D, sont étudiés comme traitements anticancéreux.

💡 Astuce mémo

Hsp70 élevée → inhibition de l’apoptose → agressivité tumorale

📊 Tableaux de synthèse

Principales structures des protéines

Comparaison des principales méthodes