Fiche de révision : Méthodes expérimentales en biologie

📋 Plan du Cours

1. Notions expérimentales et génétiques
2. Culture et populations cellulaires
3. Transfection et lignées stables
4. Western blot et analyse protéique
5. Fractionnement des compartiments cellulaires
6. Immunoprécipitation des protéines et de la chromatine
7. Immunofluorescence et microscopie
8. Microscopie électronique à transmission
9. Cytométrie en flux et applications
10. Prolifération et survie cellulaire
11. Démontrer l’apoptose et sa voie
12. Autophagie et mitophagie
13. Fonction et continuité mitochondriales
14. PCR et expression génique
15. Adhérence, mécanique et migration
16. Microtubules et dynamique cellulaire
17. Modèles tumoraux et cellules souches
18. Statistiques et interprétation des données

📖 1. Notions expérimentales et génétiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Cellules initiatrices de tumeur : Une petite sous-population capable de s’auto-renouveler et de reformer une tumeur après greffe.
• Protéine de fusion : Association, dans le même cadre de lecture, de l’ADNc du gène d’intérêt et de l’ADNc d’un tag, produisant une seule protéine.
• Effet pléiotrope : Effet secondaire qui n’est pas lié à la cible visée.

★ À maîtriser

• Dans CRISPR/Cas9, l’ARN guide dirige Cas9 vers le gène cible, Cas9 coupe l’ADN, puis une réparation imparfaite crée des insertions ou délétions susceptibles de détruire le gène.

• Les modalités expérimentales se distinguent ainsi :

  • In vitro : hors d’un organisme
  • In vivo : dans l’animal entier
  • Ex vivo : sur des cellules ou tissus prélevés
  • In situ : directement dans le tissu ou la cellule

• Une lignée cellulaire est constituée de cellules cancéreuses ou immortalisées qui se divisent indéfiniment, tandis que les cellules primaires sont prélevées chez un patient ou un animal et ont une durée de vie limitée.

• La transfection introduit de l’ADN ou de l’ARN par un moyen non viral, tandis que l’infection ou transduction transfère du matériel génétique au moyen d’un virus modifié.

• Une transfection transitoire exprime un plasmide non intégré pendant quelques jours, avec une expression indiquée de 24 à 72 h, tandis qu’une transfection stable repose sur l’intégration du plasmide au génome et la sélection des cellules.

• Un gain de fonction surexprime une protéine pour tester ce qui est suffisant, tandis qu’une perte de fonction supprime ou diminue la protéine pour tester ce qui est nécessaire.

Compléments

• Dans un plasmide d’expression, l’origine de réplication permet la multiplication du plasmide dans E. coli, AmpR sélectionne les bactéries porteuses, le promoteur détermine où et quand transcrire, l’ADNc contient le gène d’intérêt sans introns, le tag facilite la détection ou la purification, polyA participe à la terminaison et à la stabilité de l’ARNm, et un gène de résistance eucaryote sélectionne les cellules transfectées.

• Un siRNA est un duplex d’environ 21 nucléotides pris en charge par RISC, qui dégrade l’ARNm complémentaire et produit un knockdown transitoire de 3 à 5 jours.

📌 Dans le système TET-ON, la doxycycline active la transcription en favorisant la fixation de rtTA au TRE, tandis que dans le système TET-OFF, elle décroche le transactivateur du TRE et éteint le gène.

📖 2. Culture et populations cellulaires

★ À maîtriser

• La culture cellulaire de base utilise des cellules à 37 °C, sous 5 % de CO2 et en atmosphère humide, dans du RPMI ou du DMEM avec 10 % de SVF et des antibiotiques.

📌 La privation de sérum bloque les cellules en G0/G1 et leur remise en sérum permet un redémarrage synchrone, tandis que le nocodazole dépolymérise les microtubules et bloque la mitose en G2/M.

Compléments

• Pour sélectionner des cellules résistantes à un médicament, on applique d’abord une faible dose non létale, puis on augmente progressivement la dose avec des repiquages.

• Les cellules souches tumorales peuvent être isolées par FACS sur des marqueurs de surface comme EpCAM/CD133 ou CD44/CD24, puis cultivées en sphères sans sérum sur des plaques à très faible adhérence.

• Les lignées cellulaires sont contrôlées pour détecter les mycoplasmes et authentifiées par empreinte STR.

• Le passage sur laine de nylon retient les cellules adhérentes B et les macrophages, tandis que les lymphocytes T passent.

• Des cellules à fluorescence mitochondriale stable sont obtenues par transfection stable d’un plasmide codant une protéine fluorescente adressée aux mitochondries, puis sélection d’un clone.

💡 Astuce mémo

Synchroniser aligne les cellules ; bloquer les accumule dans une phase.

📖 3. Transfection et lignées stables

🔑 Notions clés & Définitions

• Sauvetage : Réintroduction du gène dans des cellules où il a été éteint ; la disparition du phénotype indique que l’effet est dû à ce gène.

★ À maîtriser

• En lipofection, on prépare séparément le plasmide et le réactif dans un milieu sans sérum, on les mélange pour former des lipoplexes, on ajoute ceux-ci aux cellules, on change le milieu quelques heures après et on analyse l’expression à 24-48 h.

• Pour produire un virus, on transfecte le plasmide viral dans des cellules d’emballage, on récolte le surnageant viral 2 jours après, puis on le met en contact avec les cellules cibles et du polybrène avant analyse ou sélection.

📌 La transfection transitoire convient à une expression rapide de quelques jours, l’infection rétrovirale ou lentivirale à une expression durable, et la transfection stable suivie d’une sélection et d’un clonage à une population homogène à expression constante.

Compléments

• Pour valider une extinction par siRNA ou shRNA, on mesure la baisse de l’ARNm par RT-qPCR et celle de la protéine par WB, en utilisant au moins deux séquences différentes et un contrôle scramble.

• Lors d’une transfection stable, la puromycine peut être ajoutée à 0,5 µg/mL après 2 jours, puis des colonies résistantes se forment en environ 2 semaines.

• Pour exclure un effet du site d’insertion après clonage monoclonal, il faut conserver au moins 2 clones indépendants.

📌 Les rétrovirus n’infectent que les cellules en division, tandis que les lentivirus infectent aussi les cellules quiescentes.

💡 Astuce mémo

siRNA : extinction brève ; shRNA intégré : extinction durable.

📖 4. Western blot et analyse protéique

🔑 Notions clés & Définitions

• Western blot : Méthode qui détecte et compare la quantité et la taille de protéines dans un échantillon, mais ne renseigne pas sur leur localisation cellulaire.

★ À maîtriser

• Le Western blot sépare les protéines par taille, les transfère sur une membrane, les reconnaît avec un anticorps spécifique puis révèle cet anticorps.

• En Western blot, la position d’une bande indique la taille de la protéine et son intensité indique sa quantité relative de manière semi-quantitative.

Compléments

• En SDS-PAGE, le SDS dénature les protéines et leur confère une charge négative proportionnelle à leur taille ; elles migrent vers l’anode dans le gel, les petites protéines parcourant une plus grande distance.

• Lors de la révélation par chimioluminescence, le substrat ECL produit de la lumière au niveau de la HRP, puis une caméra capture le signal.

• Le dosage des protéines avant dépôt permet de charger une même quantité par puits, et un contrôle de charge comme β-actine, GAPDH ou tubuline sert à normaliser les bandes.

• Une bande à 85 kDa peut correspondre au fragment de PARP clivé par les caspases, tandis que LC3-II, forme lipidée de LC3, migre plus loin que LC3-I.

💡 Astuce mémo

Séparer, transférer, reconnaître, révéler.

📖 5. Fractionnement des compartiments cellulaires

🔑 Notions clés & Définitions

• Fractionnement cellulaire : Séparation des compartiments afin d’y attribuer une protéine ou de distinguer des formes d’une même protéine.

★ À maîtriser

• Pour séparer mitochondries et cytosol, une centrifugation à environ 600-1 000 g élimine noyaux et débris, puis une centrifugation à environ 10 000 g place les mitochondries dans le culot et le cytosol dans le surnageant.

• La présence de cytochrome c dans le cytosol indique l’ouverture de la membrane externe mitochondriale et l’engagement de l’apoptose.

Compléments

• Pour séparer noyaux et cytoplasme, on gonfle les cellules en tampon hypotonique, on rompt la membrane plasmique puis une centrifugation lente place les noyaux dans le culot et le cytoplasme dans le surnageant.

📌 Une protéine qui passe au culot seulement en présence de taxol se lie aux microtubules polymérisés ; le déplacement de tubuline vers P indique une stabilisation, tandis que son déplacement vers S indique une déstabilisation.

📌 Dans la séparation P/S/T de la tubuline, P contient les microtubules assemblés, S les dimères libres α/β et T la tubuline totale.

• En cosédimentation, le taxol stabilise et polymérise les microtubules, puis une ultracentrifugation à 100 000 g pendant 1 h les place dans le culot avec les protéines qui s’y fixent.

💡 Astuce mémo

Culot : mitochondries ou microtubules assemblés ; surnageant : cytosol ou tubuline libre.

📖 6. Immunoprécipitation des protéines et de la chromatine

🔑 Notions clés & Définitions

• Immunoprécipitation : Isolement d’une protéine et des molécules qui lui sont associées à partir d’un lysat, grâce à un anticorps fixé sur des billes.
• GST pull-down : Utilisation d’une protéine de fusion GST-X fixée aux billes de glutathion pour tester une interaction avec une protéine candidate, notamment avec des protéines purifiées.
• ChIP : Méthode qui détermine si une protéine ou une marque d’histone est fixée sur une région précise de l’ADN dans la cellule.

★ À maîtriser

• La ChIP fixe les interactions protéine-ADN au formaldéhyde, fragmente la chromatine, immunoprécipite la protéine ciblée, purifie l’ADN associé puis le quantifie par qPCR avec des amorces de la région étudiée.

📌 Un enrichissement ChIP démontre une présence accrue sur une région d’ADN, mais ne prouve pas à lui seul une action fonctionnelle ; un test luciférase ou une RT-qPCR de l’ARNm cible peut compléter l’analyse.

📌 La colocalisation montre que deux protéines sont au même endroit, la co-immunoprécipitation qu’elles appartiennent au même complexe sans prouver une liaison directe, et un pull-down avec protéines purifiées peut démontrer une interaction directe.

Compléments

• Une IP se réalise en lysant les cellules en conditions non dénaturantes, en clarifiant le lysat, en capturant la cible avec un anticorps et des billes, en lavant, puis en éluant avant analyse par WB ou spectrométrie de masse.

• La cartographie d’une interaction utilise des fragments tronqués ou des mutants alanine pour repérer la région nécessaire à la liaison et tester son rôle biologique.

• En far-Western, la protéine A est déposée sur gel puis transférée sur membrane, la membrane est incubée avec la protéine B purifiée et un signal révélé avec un anticorps anti-B indique une liaison de B à A.

• Les contrôles d’IP comprennent l’input, qui représente 5 à 10 % du lysat avant IP, une IgG non immune ou un vecteur vide comme contrôle négatif, et éventuellement une IP réciproque.

• La chromatine est fragmentée par sonication en fragments de 200-500 pb avant immunoprécipitation.

• Le résultat de ChIP est exprimé en pourcentage de l’input ou en enrichissement par rapport à l’IgG.

💡 Astuce mémo

Colocalisation, co-IP, interaction directe, cartographie.

📖 7. Immunofluorescence et microscopie

🔑 Notions clés & Définitions

• Immunofluorescence : Utilisation d’anticorps marqués par des fluorochromes pour localiser une protéine ou étudier la morphologie cellulaire.
• Microscopie confocale : Balayage de l’échantillon par laser et sélection de la lumière du plan focal par un diaphragme pinhole, produisant des coupes optiques nettes et des piles 3D.

📝 Points essentiels

• En immunofluorescence sur cellules fixées, on fixe les cellules au paraformaldéhyde ou au méthanol, on perméabilise si nécessaire, on sature, on incube avec l’anticorps primaire puis le secondaire fluorescent, on colore les noyaux et on observe au microscope.

📌 Une quantification fiable en microscopie consiste à compter au moins 100 cellules par condition, dans plusieurs champs et expériences indépendantes, en aveugle, puis à classer les phénotypes et effectuer un test statistique.

• La superposition de signaux rouge et vert peut apparaître jaune, et la colocalisation peut être quantifiée par les coefficients de Manders ou de Pearson.

📌 L’immunohistochimie applique le principe des anticorps à des coupes de tissu et révèle souvent le signal par HRP et DAB, qui produit une coloration brune.

💡 Astuce mémo

La colocalisation indique un même lieu, pas une interaction directe.

📖 8. Microscopie électronique à transmission

🔑 Notions clés & Définitions

• Microscopie électronique à transmission : La microscopie électronique à transmission permet d’observer l’ultrastructure à résolution nanométrique, notamment les mitochondries et les autophagosomes.

📝 Points essentiels

• La préparation pour MET comprend la fixation au formaldéhyde et au glutaraldéhyde, la post-fixation à l’osmium, la coloration à l’acétate d’uranyle, la déshydratation à l’éthanol, l’inclusion en résine, la coupe ultrafine et l’observation sur grille de cuivre.

• Les coupes ultrafines pour MET ont une épaisseur de 55-60 nm.

• Après un knockout de Drp1, la longueur moyenne des mitochondries augmente de 0,53 à 1,26 µm, ce qui indique une fusion accrue.

• En MET, un autophagosome contenant une mitochondrie permet d’observer une mitophagie, tandis qu’une diminution du nombre de mitochondries par cellule indique une masse mitochondriale moindre.

📌 La MET observe des cellules mortes et fixées et porte sur peu de cellules, tandis que des méthodes comme MitoTracker, la mesure de l’ADN mitochondrial ou le WB peuvent compléter l’analyse quantitative.

💡 Astuce mémo

Fixer, post-fixer, colorer, déshydrater, inclure, couper.

📖 9. Cytométrie en flux et applications

★ À maîtriser

• Pour mesurer le contenu en ADN par iodure de propidium, les cellules sont fixées et perméabilisées à l’éthanol froid, traitées à la RNase A, marquées à l’IP puis analysées en cytométrie.

📌 La cytométrie en flux mesure cellule par cellule des propriétés de fluorescence et de diffusion sur des milliers de cellules par seconde, et produit une distribution plutôt qu’une moyenne.

• En cytométrie, la diffusion avant (FSC) renseigne sur la taille cellulaire, tandis que la diffusion latérale (SSC) renseigne sur la granularité et la complexité interne.

• Les contrôles de cytométrie comprennent les cellules non marquées pour l’autofluorescence, l’isotype pour le bruit de fond des anticorps, les marquages simples pour la compensation et un contrôle positif adapté à la condition.

• La fluorescence de l’iodure de propidium est proportionnelle à la quantité d’ADN cellulaire ; le premier pic correspond à G0/G1 (2n), le second à G2/M (4n) et la phase S se situe entre les deux.

Compléments

• La focalisation hydrodynamique aligne les cellules une par une devant le laser, puis filtres et détecteurs mesurent leur fluorescence et un ordinateur produit histogrammes, dot plots et fenêtres de sélection.

• Pour marquer une protéine intracellulaire en cytométrie, on fixe les cellules, on les perméabilise, puis on applique un anticorps primaire et un anticorps secondaire fluorescent.

📌 Le tri cellulaire (cell sorting) est une fonction du cytomètre qui charge et dévie des gouttelettes contenant une cellule afin de collecter une sous-population vivante.

📌 Un pic sub-G1 après fixation et perméabilisation indique un ADN fragmenté, tandis que l’IP sans perméabilisation marque les cellules dont la membrane est rompue.

• L’IP ne distingue pas G2 de M, car les deux phases ont 4n d’ADN, et les doublets G1 peuvent imiter des cellules G2/M.

• La sonde BrdU est un analogue de la thymidine incorporé dans l’ADN pendant la phase S ; un pulse de BrdU suivi d’un anticorps anti-BrdU identifie directement les cellules en réplication.

💡 Astuce mémo

FSC = taille ; SSC = complexité

📖 10. Prolifération et survie cellulaire

★ À maîtriser

• Le test clonogénique consiste à ensemencer les cellules à faible densité, les traiter, laisser les colonies se former, puis les fixer, les colorer au cristal violet et les compter.

📌 Le comptage cellulaire mesure le nombre de cellules, le MTT et l’ATPlite mesurent une activité métabolique, et le test clonogénique mesure la capacité durable d’une cellule isolée à former une colonie.

📌 Une baisse du signal MTT ou ATP peut traduire une diminution du métabolisme sans mort cellulaire, tandis qu’un arrêt en G1 réduit le nombre de cellules sans nécessairement les tuer.

Compléments

• Le MTT est réduit par les déshydrogénases des cellules vivantes en formazan violet, dont l’absorbance après dissolution est proportionnelle au nombre de cellules métaboliquement actives.

📐 Formule - Dans l’ATPlite, la réaction $\text{luciférine} + \text{ATP} + \text{O}_2 \rightarrow \text{oxyluciférine} + \text{lumière}$ produit une luminescence proportionnelle à l’ATP présent.

• La fraction de survie est égale au nombre de colonies traitées divisé par le produit du nombre de cellules ensemencées et de l’efficacité de clonage du témoin.

• Dans un test de cytotoxicité par colorant imperméant, le colorant marque les cellules à membrane rompue et la concentration provoquant 50 % de l’effet maximal correspond à l’EC50.

💡 Astuce mémo

Prolifération ≠ viabilité ≠ cytotoxicité

📖 11. Démontrer l’apoptose et sa voie

🔑 Notions clés & Définitions

• TUNEL : Détecte in situ les cassures de l’ADN en ajoutant des dUTP fluorescents aux extrémités 3′-OH libres grâce à l’enzyme TdT.

★ À maîtriser

• Un pic sub-G1 en cytométrie après fixation et marquage à l’IP indique des cellules dont l’ADN fragmenté est devenu hypodiploïde.

• Le clivage de PARP en un fragment de 85 kDa et le clivage de la caspase-9 sont des indices d’activation des caspases dans l’apoptose.

• La voie mitochondriale de l’apoptose peut être étayée par une perte de ΔΨm, la libération du cytochrome c et l’activation de la caspase-9.

Compléments

📌 Si l’inhibiteur large de caspases zVAD-fmk bloque la mort cellulaire, cela indique que cette mort dépend des caspases.

📌 Le dominant négatif de FADD bloque la voie Fas mais ne bloque pas la mort induite par le taxol ou Tat, ce qui distingue ces morts de la voie extrinsèque Fas.

• L’annexine V marque la phosphatidylsérine exposée à la surface des cellules en apoptose précoce ; l’annexine V+/IP− correspond à l’apoptose précoce et l’annexine V+/IP+ à l’apoptose tardive ou à la nécrose.

📖 12. Autophagie et mitophagie

★ À maîtriser

📌 L’ajout de chloroquine ou de bafilomycine bloque la dégradation lysosomale ; une hausse supplémentaire de LC3-II en présence de chloroquine indique un flux autophagique actif.

📌 Une hausse de LC3-II peut résulter d’une augmentation de la formation des autophagosomes ou d’un blocage de leur dégradation lysosomale.

• La colocalisation de LC3 avec TOM20 ou MitoTracker, la présence de mitochondries dans des autophagosomes en MET et la perte de masse mitochondriale constituent des indices de mitophagie.

Compléments

• En microscopie, GFP-LC3 passe d’une distribution diffuse dans le cytosol à des puncta verts lorsque des autophagosomes sont visibles.

📌 Une diminution de l’ADNmt, du nombre de mitochondries ou du complexe I, sans baisse de Ppargc1a ni de Tfam, soutient une perte mitochondriale par mitophagie plutôt qu’une baisse de biogenèse.

• Les mitochondries fusionnées en excès peuvent être éliminées par mitophagie dans un mécanisme de contrôle qualité.

💡 Astuce mémo

Chloroquine bloque la dégradation → révèle le flux autophagique

📖 13. Fonction et continuité mitochondriales

★ À maîtriser

• La rhodamine 123, DiOC6, TMRE et TMRM s’accumulent dans les mitochondries polarisées, et une baisse de fluorescence indique une dépolarisation.

• Une perte de ΔΨm est un événement précoce de l’apoptose par voie mitochondriale, mais elle n’implique pas nécessairement la mort cellulaire.

Compléments

• 🔄 Les injections se succèdent dans cet ordre :

  1. L’oligomycine bloque l’ATP synthase.
  2. Le FCCP dissipe le gradient de protons et déclenche la respiration maximale.
  3. La roténone et l’antimycine A arrêtent la chaîne respiratoire mitochondriale.

• En FRAP, on photoblanchit une région d’une mitochondrie fluorescente puis on suit la récupération du signal ; une récupération rapide indique un réseau mitochondrial connecté.

📌 FCCP ou CCCP dissipe le ΔΨm et sert de contrôle négatif pour vérifier qu’une sonde de potentiel cesse alors de s’accumuler dans les mitochondries.

📌 La cytométrie mesure la fluorescence cellule par cellule sans localisation spatiale, tandis que la microscopie révèle où se trouve la fluorescence et la morphologie cellulaire.

• Avec JC-1, les mitochondries polarisées présentent des agrégats rouges, tandis qu’une chute du ΔΨm favorise les monomères verts ; le rapport rouge/vert est indépendant de la masse mitochondriale.

• Dans le Mito Stress Test, la capacité de réserve est égale à la respiration maximale moins la respiration basale.

• Le rapport ADNmt/ADNn mesuré par qPCR à partir de gènes mitochondriaux et nucléaires reflète la masse mitochondriale.

📖 14. PCR et expression génique

🔑 Notions clés & Définitions

• PCR : Amplifie de façon exponentielle une séquence d’ADN à l’aide d’une matrice, de deux amorces, d’une polymérase thermostable et de dNTP.

★ À maîtriser

• En RT-PCR, l’ARN extrait est rétrotranscrit en ADNc, puis l’ADNc est amplifié par PCR avec des amorces spécifiques du gène étudié.

• En qPCR, un Ct plus faible indique une quantité initiale de matrice plus élevée, car le seuil de fluorescence est atteint après moins de cycles.

• En PCR spécifique de la méthylation, le bisulfite convertit les cytosines non méthylées en uraciles, lues comme des thymidines après PCR, tandis que les cytosines méthylées restent protégées.

Compléments

• Un cycle de PCR comprend la dénaturation à 95 °C, l’hybridation des amorces à 50–60 °C et l’élongation à 72 °C.

• La quantification relative ΔΔCt normalise le Ct du gène cible à celui d’un gène de ménage, puis compare cette valeur à la condition témoin.

• Dans le test rapporteur luciférase, un promoteur cloné devant la luciférase permet d’estimer l’activité du promoteur par la luminescence après transfection.

💡 Astuce mémo

ARN → ADNc → amplification

📖 15. Adhérence, mécanique et migration

🔑 Notions clés & Définitions

• Microscopie de force atomique : Mesure la topographie, l’élasticité et la force d’adhésion d’une cellule à l’aide d’une pointe nanométrique fixée à un levier souple.

★ À maîtriser

• Dans le test de détachement à la trypsine, des cellules qui se détachent plus rapidement sont moins adhérentes à la matrice.

Compléments

• En microscopie de force atomique, plus la pointe s’enfonce pour une force donnée, plus la membrane est molle ; la force nécessaire pour décoller la pointe mesure l’adhésion.

• La rigidité cellulaire dépend surtout de l’actine corticale ; une diminution de l’actine ou sa coupure par la gelsoline rend la membrane plus souple et la cellule plus déformable.

📌 Le test de cicatrisation mesure la fermeture d’une brèche dans un tapis cellulaire, tandis que le test de Boyden mesure la migration à travers les pores d’une membrane vers un chimio-attractant.

• Une hausse de vimentine et une baisse d’E-cadhérine sont des marqueurs de transition épithélio-mésenchymateuse.

💡 Astuce mémo

Moins d’actine corticale → membrane plus souple → cellule plus déformable

📖 16. Microtubules et dynamique cellulaire

★ À maîtriser

• En turbidimétrie, la tubuline purifiée polymérise en présence de GTP à 37 °C, les microtubules diffusent la lumière et l’absorbance augmente au cours de la polymérisation.

📌 Le taxol stabilise les microtubules en empêchant leur dépolymérisation, tandis que le nocodazole et les vinca-alcaloïdes les déstabilisent ; ces perturbations peuvent bloquer la mitose en G2/M.

Compléments

• La courbe turbidimétrique de polymérisation de la tubuline présente une phase de nucléation, une phase d’élongation et un plateau.

• En microscopie in vitro, SSRP1 favorise des faisceaux de microtubules plus épais et des réseaux plus denses.

• Le nocodazole fragmente le réseau de microtubules, tandis que le taxol forme des faisceaux enchevêtrés ; Tat et SSRP1 produisent un aspect de type taxol.

• L’immunoprécipitation GST pull-down met en évidence une interaction de la tubuline avec les régions N-terminale et centrale de SSRP1 et avec le domaine Val-Cys-Phe-Ile de Tat.

📖 17. Modèles tumoraux et cellules souches

🔑 Notions clés & Définitions

• Cellule souche tumorale : Cellule capable d’auto-renouvellement, de différenciation et d’initiation tumorale.

★ À maîtriser

📌 Une xénogreffe implante des cellules humaines chez une souris immunodéficiente, tandis qu’une greffe syngénique implante des cellules murines chez une souris du même fond génétique et conserve un système immunitaire intact.

• La dilution limite in vivo, qui greffe des nombres décroissants de cellules, est le test le plus exigeant pour estimer la fréquence des cellules initiatrices de tumeur.

Compléments

📌 Une greffe orthotopique est réalisée dans l’organe d’origine, tandis qu’une greffe hétérotopique est réalisée ailleurs, souvent sous la peau du flanc.

• Les modèles in vivo intègrent le microenvironnement, la vascularisation et le système immunitaire, et permettent d’évaluer si un effet observé en culture améliore la survie.

📌 La formation de tumorsphères teste l’auto-renouvellement in vitro, mais ne suffit pas à démontrer une capacité d’initiation tumorale.

• La transplantation en série consiste à greffer dans une seconde souris les cellules provenant d’une première tumeur afin d’évaluer l’auto-renouvellement in vivo.

💡 Astuce mémo

La sphère teste l’auto-renouvellement in vitro ; la dilution limite teste l’initiation tumorale in vivo

📖 18. Statistiques et interprétation des données

★ À maîtriser

📌 Une valeur p inférieure à 0,05 est considérée comme statistiquement significative.

📌 Les réplicats biologiques correspondent à des expériences indépendantes, tandis que les réplicats techniques sont des mesures répétées du même échantillon.

Compléments

📌 L’aveugle consiste à empêcher la personne qui compte les résultats de connaître les conditions expérimentales afin de limiter les biais.

• Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SD ou SEM avec le nombre d’expériences indépendantes, généralement au moins 3.

• Les analyses adaptées comprennent :

  • Le test t de Student pour deux groupes.
  • L’ANOVA pour au moins trois groupes.
  • Le test log-rank pour les courbes de survie.
  • Le test χ² pour l’ELDA.
  • Le test de Wilcoxon pour les données non gaussiennes.

• TCGA rassemble des données de tumeurs de patients liées notamment à l’expression génique et à la survie, GSE désigne des jeux d’expression publics, et COSMIC/Oncotator concerne les mutations.

📊 Tableaux de synthèse

Tests de prolifération et de survie