Fiche de révision : Méthodes structurales des interactions protéiques

📋 Plan du Cours

1. Approches d’étude des interactions protéiques
2. Principe, applications et limites du double hybride en levure
3. Chromatographie d’affinité protéique et rétention sur colonne
4. Co-immunoprécipitation des complexes
5. Résonance plasmonique de surface
6. Titration calorimétrique isotherme
7. Thermodynamique et ITC
8. Principes de fluorescence
9. Anisotropie de fluorescence
10. Transfert d’énergie par FRET
11. Mesure des interactions par FRET
12. Transfert bioluminescent par BRET
13. Cristallographie et structures protéiques
14. RMN et expérience hétéronucléaire
15. RMN homonucléaire et méthode STD

📖 1. Approches d’étude des interactions protéiques

★ À maîtriser

📌 La prédiction des IPP est informatique et peut être empirique ou théorique, tandis que leur détection est expérimentale et peut être directe ou indirecte.

• Plusieurs méthodes complémentaires sont souvent nécessaires pour éliminer les faux positifs et confirmer une interaction protéique.

• L’affinité des partenaires identifiés peut être vérifiée par résonance plasmonique de surface (SPR) ou par des analyses structurales telles que la cristallographie et la résonance magnétique nucléaire (RMN).

Compléments

📌 La caractérisation des IPP peut être réalisée par modélisation informatique ou par des méthodes expérimentales.

• La détection expérimentale des IPP peut être menée in vivo ou in vitro.

• Une interaction détectée peut être indirecte, par l’intermédiaire d’un partenaire commun, ou non physiologique, notamment si les conditions expérimentales la favorisent alors qu’elle n’existe pas in vivo.

📖 2. Principe, applications et limites du double hybride en levure

🔑 Notions clés & Définitions

• Double hybride en levure : Méthode de clonage par interaction in vivo chez Saccharomyces cerevisiae, développée en 1989 et présentée comme la plus sensible.

★ À maîtriser

• De nombreux facteurs activateurs de transcription eucaryotes nécessitent deux domaines : un domaine de liaison à l’ADN (DLA) et un domaine activateur (DA).

• Dans le double hybride, le DLA est fusionné à la protéine A et le DA à la protéine B ; si A et B interagissent, le facteur de transcription est reconstitué et le gène rapporteur lacZ est exprimé.

• Le double hybride peut tester une interaction soupçonnée entre deux protéines ou domaines, ou rechercher de nouveaux partenaires dans une banque de protéines fusionnées à partir d’une protéine appât.

• Le double hybride offre des conditions in vivo plus proches des conditions physiologiques des protéines d’eucaryotes supérieurs et permet certaines modifications post-traductionnelles eucaryotes, mais pas toutes.

• Les résultats du double hybride peuvent être confirmés par immunoprécipitation ou chromatographie, puis par la démonstration que les partenaires appartiennent à un même processus biologique.

Compléments

• Dans le système GAL4, le DLA se fixe à des régions spécifiques du promoteur des gènes GAL 1-10, tandis que le DA recrute la machinerie de transcription.

• Lorsque le promoteur des gènes GAL 1-10 est fusionné à la région codante de lacZ, l’expression de lacZ est placée sous le contrôle de GAL4.

• Le gène lacZ code la β-galactosidase, qui métabolise le X-gal et provoque une coloration bleue détectable.

• La séparation du DLA et du DA empêche l’activation de la transcription, car le DA n’est plus positionné par rapport à sa cible.

• Le double hybride permet d’établir des cartes d’IPP et d’étudier in vivo l’interaction entre deux protéines ou domaines protéiques.

• Le système permet d’étudier l’influence d’un inhibiteur de l’interaction ciblée lorsqu’il est introduit dans le milieu.

• Sa sensibilité supérieure à celle des tests in vitro permet de détecter des interactions faibles qui ne sont pas décelables par immunoprécipitation.

• La toxicité, l’instabilité des protéines ou la nécessité d’un troisième partenaire peuvent empêcher la détection d’une interaction par double hybride.

• Le double hybride peut produire des faux positifs lorsqu’un peptide non spécifique active le domaine activateur et ne s’applique pas aux protéines membranaires.

💡 Astuce mémo

La sensibilité révèle des interactions faibles, mais les faux positifs et les contraintes expérimentales limitent la détection.

📖 3. Chromatographie d’affinité protéique et rétention sur colonne

★ À maîtriser

• La nature du ligand immobilisé et les conditions du tampon de liaison déterminent la spécificité de la rétention des protéines sur la matrice d’affinité.

• Les protéines retenues peuvent être éluées par :

  • de fortes concentrations en sels
  • des cofacteurs
  • des détergents

• La chromatographie d’affinité immobilise une protéine d’intérêt, éventuellement fusionnée à la GST, sur une matrice telle que la sépharose, puis met cette matrice en contact avec les protéines ligands d’un extrait cellulaire.

• La chromatographie d’affinité permet de tester de façon équivalente la liaison de toutes les protéines d’un extrait cellulaire et de mettre en évidence des interactions dépendant d’un complexe multiprotéique.

• La chromatographie d’affinité peut manquer une interaction si le couplage, la fusion ou la résine modifie la structure native ou empêche le contact entre les protéines.

Compléments

• Beaucoup de protéines sont exclues des colonnes d’affinité ou facilement éliminées par de faibles concentrations en sels.

• L’analyse des protéines éluées comprend une migration électrophorétique, puis une révélation du gel au nitrate d’argent ou au bleu de Coomassie.

📌 La protéine d’intérêt doit présenter un haut niveau de pureté pour être couplée à la matrice.

• Des protéines mutées ou tronquées fusionnées à la protéine étudiée permettent de déterminer les résidus ou domaines critiques pour l’interaction protéine-protéine.

• La chromatographie d’affinité peut produire de fausses interactions et ne permet pas de prendre en compte les modifications post-traductionnelles.

💡 Astuce mémo

Contact avec la matrice, élution, migration électrophorétique, révélation.

📖 4. Co-immunoprécipitation des complexes

🔑 Notions clés & Définitions

• Co-immunoprécipitation : Technique qui isole un complexe protéique à l’aide d’un anticorps dirigé contre l’un de ses membres, ce qui permet d’isoler puis d’identifier ses partenaires protéiques.

★ À maîtriser

• 🔄 La co-immunoprécipitation se déroule ainsi :

  1. L’anticorps est ajouté à un lysat cellulaire ou à une fraction subcellulaire.
  2. Le complexe antigène-anticorps est lavé.
  3. Les protéines liées au complexe sont analysées.

• La co-immunoprécipitation conserve des partenaires à des concentrations relatives physiologiques et permet d’étudier des interactions dépendant de la maturation post-traductionnelle.

Compléments

• La forte affinité antigène-anticorps permet des lavages à forte force ionique pour éliminer les partenaires faiblement liés sans dissocier la liaison antigène-anticorps.

📌 La protéine A ou la protéine G couplée à des billes de sépharose sert à l’immunoprécipitation, et le choix entre elles dépend de l’anticorps utilisé.

• La co-immunoprécipitation peut échouer si la quantité d’antigène est faible ou si l’épitope de la protéine appât est masqué dans le complexe.

📌 Les anticorps polyclonaux utilisés en co-immunoprécipitation doivent être prépurifiés par affinité pour leur antigène afin d’éliminer les anticorps contaminants du sérum.

📖 5. Résonance plasmonique de surface

★ À maîtriser

• En résonance plasmonique de surface, un partenaire est immobilisé sur une surface d’or de manière covalente ou par biocapture, puis l’autre partenaire circule jusqu’à cette surface dans un flux continu.

• En SPR, l’association ou la dissociation des complexes modifie la masse et la réfringence du milieu, ce qui déplace l’angle de résonance et produit un signal enregistré en temps réel.

• La SPR permet de caractériser la spécificité, l’affinité et la cinétique d’une interaction protéine-protéine, et la valeur RU renseigne sur son intensité.

Compléments

📐 Formule - En SPR, $K_D = \frac{k_d}{k_a}$, où $k_a$ (ou $k_{on}$) est la constante d’association et $k_d$ (ou $k_{off}$) la constante de dissociation.

• 🔄 Une analyse SPR comprend :
  1. La préparation de la surface de mesure.
  2. L’injection de l’échantillon.
  3. La régénération de la surface.
  4. L’évaluation et l’analyse du sensogramme enregistré en temps réel.

💡 Astuce mémo

Immobiliser, faire circuler, mesurer la masse liée.

📖 6. Titration calorimétrique isotherme

🔑 Notions clés & Définitions

• Titration calorimétrique isotherme : Méthode thermodynamique qui mesure directement la chaleur libérée ou absorbée lors de la liaison entre biomolécules en solution.

★ À maîtriser

• Une expérience ITC permet de déterminer l’affinité (KD), la stœchiométrie, l’entropie (ΔS) et l’enthalpie (ΔH) d’une réaction de liaison.

• 🔄 L’analyse ITC suit ces étapes :

  1. L’analyte est injecté à plusieurs reprises dans la cellule d’échantillon.
  2. Les variations de chaleur sont compensées pour rétablir l’égalité de température entre les cellules.
  3. Les chaleurs des pics sont intégrées.
  4. Les données sont ajustées à un modèle de liaison.

Compléments

• Un microcalorimètre ITC comporte deux cellules, l’une contenant de l’eau comme référence et l’autre l’échantillon, et maintient leur température égale en compensant les différences de chaleur par chauffage.

• Lorsqu’une protéine est progressivement saturée par le ligand, la variation de chaleur diminue jusqu’à la saturation, où le ligand est en excès par rapport à la protéine.

• En ITC, le rapport molaire au centre de l’isotherme de liaison donne la stœchiométrie, et l’enthalpie ΔH correspond à la chaleur libérée par mole de ligand lié.

• Une transformation adiabatique s’effectue sans transfert thermique entre le système étudié et le milieu extérieur.

💡 Astuce mémo

Liaison → chaleur mesurée → paramètres thermodynamiques.

📖 7. Thermodynamique et ITC

★ À maîtriser

📐 Formule - L’énergie libre de liaison vérifie $\Delta G = \Delta H - T\Delta S$.

📌 L’affinité de liaison dépend conjointement de l’enthalpie (ΔH) et de l’entropie (ΔS) de liaison, et l’énergie de liaison est corrélée à l’affinité.

• Les chaleurs mesurées au fil des injections sont intégrées puis ajustées à un modèle de liaison pour extraire l’affinité, la stœchiométrie et l’enthalpie de la réaction.

Compléments

• L’enthalpie de liaison regroupe la formation de liaisons hydrogène et d’interactions de van der Waals.

• L’entropie de liaison combine les changements dus à la désolvatation et les changements conformationnels lors de la formation du complexe, et regroupe la formation de liaisons hydrophobes et les changements conformationnels.

• En ITC, une énergie constante alimente la cellule de référence et, avant l’injection de l’analyte, la même énergie alimente la cellule de test.

• Après injection de l’analyte, la liaison provoque une variation de température ; cette variation est enregistrée et la cellule est chauffée pour retrouver la température de référence.

📖 8. Principes de fluorescence

★ À maîtriser

• L’excitation correspond à l’absorption de photons qui fait passer une molécule à un état excité.

📌 La phosphorescence passe par un état excité intermédiaire et peut durer plusieurs minutes, contrairement au retour rapide à l’état fondamental de la fluorescence.

Compléments

• La fluorescence est le retour rapide à l’état fondamental et dure environ 10⁻⁸ seconde.

• La fluorescence et la phosphorescence sont deux formes de photoluminescence, c’est-à-dire d’émission de lumière consécutive à une absorption de lumière.

• Les approches citées sont : l’anisotropie ou polarisation de fluorescence (FPA), le transfert d’énergie entre molécules fluorescentes (FRET), le transfert d’énergie entre molécules bioluminescentes (BRET)

💡 Astuce mémo

Fluorescence : retour rapide ; phosphorescence : passage intermédiaire prolongé.

📖 9. Anisotropie de fluorescence

★ À maîtriser

• L’anisotropie de fluorescence peut être mesurée avec un partenaire fluorescent et un partenaire non marqué, ou par compétition entre deux partenaires non marqués et un ligand de référence fluorescent déplacé.

📌 Une protéine marquée libre qui tourne rapidement produit une anisotropie faible, tandis qu’une protéine marquée liée qui tourne lentement produit une anisotropie forte.

Compléments

📐 Formule - L’anisotropie se calcule par $r = \frac{I_{\parallel}-I_{\perp}}{I_{\parallel}+2I_{\perp}}$.

• L’analyse par anisotropie de fluorescence comporte une mesure du Kd, puis un essai de liaison compétitive pour mesurer le Ki ou l’IC50 de la molécule.

• Un bon fluorophore doit : être facilement couplable au ligand, ne pas perturber l’activité biologique du ligand, avoir une demi-vie suffisante

💡 Astuce mémo

Libre et rapide : anisotropie faible ; liée et lente : anisotropie forte.

📖 10. Transfert d’énergie par FRET

🔑 Notions clés & Définitions

• FRET : Processus non radiatif par lequel l’énergie d’un fluorophore donneur excité est transmise à un fluorophore accepteur situé à proximité immédiate.

★ À maîtriser

• En FRET, le donneur fluorescent est excité à une longueur d’onde spécifique et peut transférer son énergie à l’accepteur, qui émet alors une fluorescence.

📌 La FRET nécessite que le donneur et l’accepteur soient séparés d’au plus 10 nm, que leurs spectres présentent un recouvrement approprié et que leur orientation soit favorable.

• La GFP a été décrite pour la première fois en 1962 et comprend 238 acides aminés pour une masse moléculaire d’environ 27 kDa.

• La GFP sauvage possède deux maxima d’excitation, à 395 nm sous lumière ultraviolette et à 475 nm sous lumière bleue, et un maximum d’émission à 504 nm.

• La GFP permet une observation non invasive en temps réel dans des cellules vivantes, contrairement à des gènes rapporteurs comme la bêta-galactosidase, qui nécessitent de fixer les cellules.

Compléments

📌 En FRET intermoléculaire, les fluorophores donneur et accepteur sont fusionnés à deux protéines différentes, tandis qu’en FRET intramoléculaire ils sont fusionnés à deux endroits d’une même protéine.

• Le couple CFP-YFP est couramment utilisé en FRET, avec la CFP comme donneur et la YFP comme accepteur.

• La GFP émet une fluorescence verte, provient d’une méduse et possède une structure en feuillets β formant une cage qui renferme un chromophore.

• Pour visualiser une protéine en cellule vivante avec la GFP, son gène peut être fusionné in vitro au gène de la protéine étudiée, puis le gène recombinant est introduit dans les cellules via un plasmide afin qu’elles synthétisent la protéine fluorescente.

• Le chromophore de la GFP, responsable de sa fluorescence, est constitué des chaînes latérales d’une glycine, d’une tyrosine et d’une sérine.

• La GFP sauvage est photo-excitable : une exposition aux photons ultraviolets intensifie sa fluorescence, propriété perdue par la plupart des variants ultérieurs.

• Les variants cités et leurs propriétés sont :

  • EGFP verte
  • CFP cyan et son variant Cerulean
  • EYFP jaune et ses variants Venus et Citrine
  • EBFP bleue et son variant Azurite
  • PA-GFP photoactivable à 405 nm
  • pHluorin, qui s’éteint à pH acide

• La GFP est relativement petite et inerte, ne semble pas interagir avec les processus biologiques d’intérêt et, étant monomérique, peut diffuser rapidement à travers les cellules.

💡 Astuce mémo

Deux fluorophores rapprochés : le donneur excite l’accepteur, qui émet à son tour.

📖 11. Mesure des interactions par FRET

★ À maîtriser

• 🔄 La mise en œuvre de la méthode suit ces étapes :

  1. Introduire dans les cellules des plasmides codant les protéines étudiées fusionnées à des protéines fluorescentes.
  2. Irradier les cellules avec des faisceaux monochromatiques adaptés aux protéines fluorescentes, au moyen de filtres.
  3. Visualiser la fluorescence à différentes longueurs d’onde.

• Le FRET permet de visualiser et de quantifier en temps réel les interactions protéine–protéine dans des cellules vivantes ou in vitro.

• Lors d’un FRET, l’excitation du donneur entraîne un transfert d’énergie vers l’accepteur, ce qui diminue la fluorescence du donneur et augmente celle de l’accepteur.

Compléments

• La quantification du FRET mesure la diminution de fluorescence du donneur et l’augmentation de fluorescence de l’accepteur à l’aide d’un fluorimètre ou d’un microscope, éventuellement sur microplaques.

• Le choix du couple donneur-accepteur est critique en FRET, car le recouvrement des spectres des fluorochromes limite souvent l’application pratique de la méthode.

• Les avantages du FRET comprennent la visualisation in vivo de l’interaction et de son perturbateur, la localisation subcellulaire de l’interaction et son étude en temps réel et en dynamique.

• Les limites du FRET comprennent le recouvrement spectral, les signaux parasites comme l’autofluorescence et l’excitation directe, l’utilisation de protéines non endogènes et la sensibilité de la GFP au pH.

💡 Astuce mémo

Interaction des protéines → transfert du donneur vers l’accepteur

📖 12. Transfert bioluminescent par BRET

🔑 Notions clés & Définitions

• Luciférase : Enzyme qui catalyse l’oxydation de la luciférine et constitue un élément clé de la réaction de bioluminescence.

★ À maîtriser

📌 Le BRET suit le principe du FRET, mais l’énergie du donneur provient d’une luciférase qui émet des photons en présence de son substrat, plutôt que d’une excitation lumineuse externe.

• En BRET, l’oxydation du substrat par la luciférase produit des photons qui transfèrent leur énergie à une protéine fluorescente de type GFP si les conditions de proximité et de géométrie sont réunies.

• Les avantages du BRET sont l’absence de source lumineuse extérieure grâce à l’enzyme qui excite le donneur, une sensibilité supérieure au FRET et une meilleure quantification, l’étude des protéines en cellules vivantes, l’utilisation possible de cellules autofluorescentes et l’adaptation au format µplaque.

Compléments

• Selon la luciférase et le substrat utilisés, la lumière bioluminescente émise a une longueur d’onde comprise entre 460 et 623 nm.

• Le premier système luciférase exploité en BRET provenait de Renilla reniformis, un cnidaire marin proche des anémones de mer, et utilisait la luciférase de Renilla comme donneur et la protéine fluorescente verte de Renilla comme accepteur.

• La luciférase oxyde la luciférine en oxyluciférine en présence d’oxygène, d’ATP et de Mg2+, ce qui émet une lumière jaune-verte et hydrolyse l’ATP en AMP.

📌 La réaction de bioluminescence exige la D(-)-luciférine pour que la réaction ait lieu.

• Dans la réaction de Renilla luciferase, l’oxydation de la coelentérazine produit de la coelentéramide à l’état excité dans le site actif ; son retour à l’état fondamental émet des photons et permet un transfert d’énergie de résonance vers un accepteur.

• BRET2 est une amélioration de BRET1 qui réduit le recouvrement des spectres d’absorption et d’émission.

• Les limites du BRET comprennent les fluctuations de la lumière émise, le recouvrement des spectres d’émission du substrat de la luciférase et de la YFP, l’orientation du donneur et de l’accepteur, la sensibilité de la GFP au pH et la difficulté d’amplifier le signal.

💡 Astuce mémo

Luciférase + substrat → photon → protéine fluorescente

📖 13. Cristallographie et structures protéiques

★ À maîtriser

• La cristallographie est présentée comme la méthode de caractérisation la plus précise des interactions protéine-protéine et permet d’obtenir la structure tridimensionnelle du complexe.

• La cristallographie permet d’identifier les acides aminés impliqués dans l’interaction et les hot-spots, points cruciaux de l’interaction entre molécules.

📌 La cristallographie exige que le complexe protéine-protéine ou inhibiteur-protéine soit co-cristallisé.

Compléments

• La cristallographie et la RMN permettent d’étudier les structures au niveau moléculaire et atomique, à l’échelle de l’ordre de l’Å.

• La Protein Data Bank (PDB) regroupe les données structurales de protéines obtenues par cristallographie ou RMN et comptait 242 296 structures le 19/9/25.

• Les hot-spots se trouvent des deux côtés de l’interface protéine-protéine, où des surfaces hautement complémentaires associent des résidus hydrophobes à des poches de la face opposée.

• La RMN a une place plus limitée que la cristallographie pour caractériser les complexes, notamment parce que l’identification précise de l’origine intra- ou intermoléculaire des signaux NOE est limitée par la taille des objets étudiés, le plus souvent de 30 à 40 kDa.

📖 14. RMN et expérience hétéronucléaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Résonance magnétique nucléaire : Analyse des propriétés magnétiques des noyaux atomiques.

★ À maîtriser

• Lors d’une interaction, l’environnement des noyaux change, ce qui fait de la RMN un outil efficace pour étudier les interactions intermoléculaires.

📌 Le criblage RMN requiert une protéine pure, soluble, idéalement à une concentration de l’ordre du millimolaire, monodisperse et de masse moléculaire inférieure à 20–30 kDa pour obtenir des signaux de bonne qualité.

• En expérience hétéronucléaire, l’enrichissement de la protéine en 15N permet d’observer les variations de ses signaux en présence de ligands sur un spectre 15N-1H HSQC.

• L’analyse HSQC compare d’abord le spectre de la protéine seule, où chaque tâche correspond à un signal attribué à un acide aminé, puis celui de la protéine avec le ligand afin d’identifier les signaux déplacés et les acides aminés perturbés par l’interaction.

• La titration RMN répète l’expérience avec des quantités croissantes de ligand à concentration constante de protéine; la variation des signaux selon la quantité de complexe formé permet d’accéder à l’affinité et au Kd.

Compléments

• Pour un proton de spin 1/2 soumis à un champ magnétique, deux niveaux d’énergie existent, avec un léger excès de population au niveau le plus bas selon la distribution de Boltzmann; les transitions entre ces niveaux constituent la résonance magnétique nucléaire.

• La RMN est peu sensible en raison de la faible polarisation de l’échantillon dans le champ magnétique; les expériences exigent donc des échantillons concentrés et stables et peuvent durer plusieurs semaines.

• Le 14N, de spin 1, est observable en RMN, mais il est préférable de marquer l’azote en RMN liquide pour lui donner un spin 1/2.

• Le 15N naturel est présent à 0,37 % et possède un spin 1/2; malgré un rapport gyromagnétique dix fois plus faible que celui du proton, il donne de bons signaux RMN.

• Un spectre HSQC corrèle un atome de 15N à son proton lié.

• La carte d’interaction obtenue par HSQC identifie les acides aminés perturbés et permet de déduire les sites d’interaction du ligand avec la protéine.

• En expérience hétéronucléaire, l’analyse exige une protéine marquée et une cartographie préalable de ses signaux, mais permet d’obtenir une cartographie précise de la protéine et le Kd.

📖 15. RMN homonucléaire et méthode STD

★ À maîtriser

• Les contraintes NOE fournissent des informations sur les distances entre atomes proches, inférieures à 5 Å, et peuvent être intra-résidu ou inter-résidus.

• La méthode STD (Saturation Transfer Difference) analyse le spectre du ligand sans nécessiter de protéine marquée ni de cartographie de la protéine cible, ce qui la rend rapide et adaptée au criblage, mais limite les informations obtenues.

• En STD, l’irradiation d’une région de la protéine éloignée du site de liaison se propage jusqu’à la poche d’interaction; si le ligand est lié, il reçoit cette irradiation et produit un signal dont l’intensité augmente avec la proximité du proton à la protéine.

Compléments

• La méthode NOESY examine les interactions entre protons dans l’espace et ne détecte que des protons séparés d’une distance inférieure à environ 5–6 Å.

• L’analyse STD compare le spectre du ligand avec protéine au spectre du ligand seul, puis au spectre de différence; les signaux les plus intenses, normalisés à 100 % pour le plus intense, indiquent les protons les plus proches de la protéine et permettent l’epitope mapping.

• La STD peut servir à déterminer le Kd et à réaliser une expérience de compétition avec un autre ligand pour observer un déplacement.

• La RMN est non destructive, s’effectue en solution, peut étudier des protéines qui ne cristallisent pas et se rapproche des conditions natives, notamment en solution aqueuse et à température ambiante.

📌 En RMN, le ligand doit être soluble dans le solvant utilisé et les conditions expérimentales, notamment le pH et la température, doivent être adaptées aux protéines.