Fiche de révision : Microscopie et méthodes cellulaires

📋 Plan du Cours

1. Principes et types de microscopes
2. Microscopie photonique en fond clair
3. Microscopie à fluorescence
4. Microscopie confocale
5. Microscopie électronique
6. Préparation et repérage des échantillons
7. Immunocytochimie et autoradiographie
8. Cytométrie en flux
9. Culture cellulaire et modèles
10. Raisonnement expérimental
11. Manipulation des acides nucléiques
12. Analyses protéiques et membranaires

📖 1. Principes et types de microscopes

🔑 Notions clés & Définitions

• Pouvoir de résolution : ou pouvoir de séparation, est la capacité à distinguer séparément deux éléments voisins.

📝 Points essentiels

📌 Le microscope photonique utilise des photons et possède un pouvoir de résolution d’environ 0,2 µm, tandis que le microscope électronique utilise des électrons et atteint environ 0,2 nm, soit une résolution environ 1 000 fois supérieure.

• Les virus ne sont pas visibles au microscope photonique mais sont visibles au microscope électronique ; ils sont plus petits qu’un ribosome et plus grands qu’une molécule d’hémoglobine.

💡 Astuce mémo

Photonique = photons et micromètres ; électronique = électrons et nanomètres

📖 2. Microscopie photonique en fond clair

★ À maîtriser

• En microscopie à transmission, la lumière traverse un objet suffisamment fin, généralement une coupe colorée lorsqu’il s’agit d’un tissu.

📌 La coloration améliore la visibilité de structures cellulaires peu visibles mais nécessite une fixation, tandis que le contraste de phase permet d’observer des cellules vivantes en culture sans coloration.

Compléments

• La coloration au May-Grünwald-Giemsa permet notamment d’observer un polynucléaire à noyau violet foncé dans un frottis sanguin.

💡 Astuce mémo

Colorer permet de voir, mais tue les cellules ; le contraste de phase observe le vivant sans coloration

📖 3. Microscopie à fluorescence

🔑 Notions clés & Définitions

• DAPI : Le DAPI est un fluorochrome qui s’intercale entre les bases de l’ADN, possède une affinité pour les bases A et T et révèle les noyaux en bleu après excitation par une lumière UV.

★ À maîtriser

• En microscopie à fluorescence, un filtre sélectionne la longueur d’onde d’excitation, un miroir dichroïque réfléchit cette lumière vers l’objet et laisse passer la lumière d’émission, puis un filtre sélectionne la longueur d’onde émise.

Compléments

• La superposition informatique de fluorescences verte et rouge produit une couleur jaune lorsque les molécules marquées sont colocalisées.

💡 Astuce mémo

Excitation → émission fluorescente → localisation moléculaire

📖 4. Microscopie confocale

★ À maîtriser

• Le microscope confocal focalise un faisceau laser sur un plan défini, acquiert des plans de coupe optique successifs et permet de reconstruire numériquement une image tridimensionnelle.

Compléments

• Le microscope confocal possède une très petite profondeur de champ et fournit une image bidimensionnelle correspondant au plan de focalisation.

💡 Astuce mémo

Plan focal → plans successifs → reconstruction 3D

📖 5. Microscopie électronique

★ À maîtriser

📌 Le microscope électronique à transmission utilise les électrons traversant une coupe fine pour observer l’ultrastructure interne, tandis que le microscope électronique à balayage capture les électrons diffractés par une surface métallique et produit une image tridimensionnelle de cette surface.

Compléments

• En MET, les sels de métaux lourds créent des contrastes en se fixant plus ou moins aux structures et en empêchant localement la transmission des électrons.

💡 Astuce mémo

MET = intérieur traversé ; MEB = surface balayée

📖 6. Préparation et repérage des échantillons

📝 Points essentiels

• La cryofracture consiste à congeler un échantillon, le fracturer puis fabriquer une réplique métallique de la surface de fracture afin de visualiser la structure des membranes cellulaires.

📌 Une molécule d’intérêt peut être repérée par une caractéristique propre, comme une protéine chimère avec la GFP, ou par la liaison spécifique d’une molécule repérable, comme le DAPI ou un anticorps marqué.

💡 Astuce mémo

Fixer → couper ou fracturer → colorer ou contraster

📖 7. Immunocytochimie et autoradiographie

🔑 Notions clés & Définitions

• Immunocytochimie : détecte une protéine d’intérêt dans ou à la surface d’une cellule à l’aide d’anticorps marqués.

★ À maîtriser

📌 La détection directe utilise un anticorps marqué reconnaissant l’antigène d’intérêt, tandis que la détection indirecte utilise un anticorps primaire non marqué puis plusieurs anticorps secondaires marqués qui amplifient le signal.

Compléments

• L’autoradiographie détecte des molécules radioactives sous forme de grains d’argent et permet d’étudier le lieu de synthèse ainsi que le devenir d’une macromolécule.

💡 Astuce mémo

Immunocytochimie repère une protéine ; autoradiographie suit une molécule radioactive

📖 8. Cytométrie en flux

🔑 Notions clés & Définitions

• FACS : trieur de cellules qui confère ou non une charge électrique à chaque cellule selon le résultat de son analyse afin de la diriger vers un collecteur.

📝 Points essentiels

• En cytométrie en flux, des particules en suspension passent une à une devant un faisceau laser et les modifications du faisceau sont analysées par un système optique.

• La cytométrie en flux permet d’analyser la taille, la structure interne, la granularité et la fluorescence des cellules.

💡 Astuce mémo

Une cellule → laser → signaux → comptage ou tri

📖 9. Culture cellulaire et modèles

🔑 Notions clés & Définitions

• Culture primaire : Une culture primaire regroupe des cellules isolées directement à partir d’un organe, comme la peau, le foie ou le tissu adipeux.
• Lignée cellulaire : un ensemble de cellules issues par divisions successives d’une cellule originelle et présentant les mêmes caractères structurels et fonctionnels.

📝 Points essentiels

• Les cellules souches issues de la masse cellulaire interne du blastocyste peuvent se diviser indéfiniment et se différencier dans des conditions adéquates.

💡 Astuce mémo

Culture primaire = proche du tissu mais limitée ; lignée = abondante et homogène

📖 10. Raisonnement expérimental

📝 Points essentiels

• 🔄 Le raisonnement scientifique suit les étapes suivantes : (Claude Bernard):
  1. Observations
  2. Hypothèse
  3. Expérience
  4. Observations expérimentales
  5. Interprétation
  6. Loi particulière
  7. Loi générale à tester

📌 Une expérience fiable exige la maîtrise des conditions expérimentales, la comparaison avec un groupe contrôle et l’obtention d’une preuve ainsi que d’une contre-preuve.

💡 Astuce mémo

Observation → hypothèse → expérience → interprétation → loi

📖 11. Manipulation des acides nucléiques

🔑 Notions clés & Définitions

• ARN interférent : réduit ou supprime la synthèse d’une protéine par hybridation avec son ARNm, ce qui constitue une inhibition post-transcriptionnelle sans mutation du gène.

★ À maîtriser

• Un long ARN double brin est clivé par Dicer en siARN de 20 à 25 paires de bases, puis le complexe RISC utilise son brin antisens pour s’hybrider à l’ARNm cible et le cliver, empêchant sa traduction.

Compléments

• Les méthodes d’introduction sont:
  • Micro-injection
  • Électroporation
  • Transfection par des liposomes
  • Transduction par des vecteurs viraux

💡 Astuce mémo

ARNi : Dicer → siARN → RISC → ARNm clivé

📖 12. Analyses protéiques et membranaires

🔑 Notions clés & Définitions

• Western blot : Le Western blot détecte spécifiquement une ou plusieurs protéines après SDS-PAGE et renseigne sur leur présence, leur quantité relative et leur poids moléculaire apparent.

📝 Points essentiels

• 🔄 Les étapes du Western blot sont:
  1. Extraction et dénaturation
  2. Séparation par SDS-PAGE
  3. Transfert sur membrane
  4. Immunodétection
  5. Révélation

📌 L’immunoprécipitation isole une protéine native et ses partenaires grâce à un anticorps fixé à des billes de Sépharose, tandis que la biotinylation de surface suit l’internalisation, le recyclage ou la dégradation de protéines membranaires exposées au milieu extracellulaire.

💡 Astuce mémo

Western blot détecte ; immunoprécipitation isole ; biotinylation suit le devenir

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des microscopes électroniques