Fiche de révision : PCR et hybridation moléculaire

📋 Plan du Cours

1. Clonage, recombinaison et sélection des clones
2. Vecteurs plasmidiques bactériens
3. Vecteurs plasmidiques de levure
4. Expression des gènes procaryotes et eucaryotes
5. Régulation de l’expression bactérienne
6. Vecteurs d’expression bactériens
7. Amplification par PCR et RT-PCR des ARN
8. Performances et limites de la PCR
9. Détection par Southern et Northern blot
10. Conception et usages des sondes
11. Dénaturation et renaturation de l’ADN
12. Spécificité et stringence d’hybridation
13. Origine et marquage des sondes
14. Renaturation selon la complexité de l’ADN
15. Marquage des sondes nucléiques
16. Détection des protéines par western blot
17. Construction et taille des banques génomiques
18. Criblage des banques génomiques
19. Criblage d’une banque métagénomique
20. Validation fonctionnelle des xylose isomérases

📖 1. Clonage, recombinaison et sélection des clones

🔑 Notions clés & Définitions

• Clonage : Permet de purifier des gènes ou fragments d’ADN sous forme de molécules caractérisées et disponibles en grande quantité.
• Vecteur navette : Vecteur pouvant se maintenir dans plusieurs hôtes cellulaires, par exemple dans E. coli et un autre hôte.

★ À maîtriser

• Le clonage consiste à préparer les fragments par restriction ou PCR, à les purifier et les ligaturer individuellement dans un vecteur, à introduire et propager séparément les vecteurs recombinants dans des lignées cellulaires clonales, puis à trier ces lignées pour repérer celles qui portent le gène recherché.

• Un vecteur de clonage doit : comporter un ou plusieurs sites de restriction uniques, être sélectionnable dans un hôte facile à cultiver, être autoréplicatif, être de petite taille, être facile à séparer du génome hôte, être si possible présent en copies multiples

• Dans le criblage lacZα, l’insertion d’ADN interrompt la production du peptide α et la complémentation avec LacZω ; les bactéries recombinantes sont Lac− et forment des colonies blanches sur milieu avec X-Gal et IPTG, tandis que les bactéries portant un vecteur intact forment des colonies bleues.

Compléments

• Les utilisations courantes du clonage comprennent : la construction de banques génomiques ou d’ARN messager, le séquençage des génomes, l’analyse ou la modification de séquences, l’expression hétérologue de gènes d’intérêt médical ou biotechnologique

• La ligature peut produire : un vecteur refermé sur lui-même, des plasmides ligaturés entre eux, des fragments ligaturés entre eux ou sur eux-mêmes, un plasmide portant un fragment inséré

• Le traitement du vecteur à la phosphatase retire ses phosphates 5′ et empêche sa refermeture par la ligase ; un fragment phosphorylé peut néanmoins se lier aux extrémités 3′OH du vecteur, et les coupures simple brin sont ensuite réparées par l’hôte.

• L’IPTG dé-réprime l’opérateur lac sans être métabolisé par E. coli, tandis que l’activité β-galactosidase libère la moitié indolyl du X-Gal, qui se dimérise et s’oxyde en un précipité bleu.

💡 Astuce mémo

Colonies blanches : insert ; colonies bleues : vecteur intact

📖 2. Vecteurs plasmidiques bactériens

🔑 Notions clés & Définitions

• Lieur multisite : Oligonucléotide synthétique bicaténaire inséré dans un site choisi d’un plasmide et fournissant plusieurs sites de clonage.

★ À maîtriser

📌 Les plasmides naturels tels que le facteur F ou R1 peuvent dépasser 100 kpb, avoir peu de sites uniques de restriction et être présents à faible nombre de copies, tandis que les vecteurs bactériens usuels sont généralement artificiels, mesurent moins de 10 kpb et sont à haut nombre de copies.

• Les vecteurs plasmidiques bactériens portent :
  • une origine de réplication
  • un marqueur de sélection
  • un ou plusieurs sites de restriction uniques

Compléments

• Une origine de réplication de type relâché peut être activée plusieurs fois par cycle de réplication chromosomique et mener, dans certains cas, à plus de 100 copies plasmidiques par cellule.

• L’entrée d’ADN exogène dans E. coli peut être facilitée par : des cations divalents à froid suivis d’un choc thermique, le DMSO, l’électroporation

• Moins d’une bactérie sur 10 000 incorpore de l’ADN lors de la transformation, et les grands plasmides transforment moins efficacement que les petits.

📖 3. Vecteurs plasmidiques de levure

★ À maîtriser

• Pour sélectionner des levures transformées, un vecteur peut porter URA3 sauvage et complémenter une souche ura3 incapable de croître en milieu minimum sans uracile ; les cellules transformées peuvent alors y croître.

• Les vecteurs de levure sont des vecteurs navettes construits sur un squelette plasmidique d’E. coli de type pBR322 auquel sont ajoutés des éléments de maintien chez la levure, comme une origine de réplication chromosomique, un centromère ou un télomère.

📌 Une intégration par simple échange ajoute le plasmide et duplique la région homologue de part et d’autre de l’insertion, tandis qu’une intégration par double échange remplace la séquence cible.

Compléments

• Les vecteurs intégratifs de levure portant un marqueur et le gène d’intérêt s’intègrent principalement au génome par recombinaison homologue.

📌 La recombinaison homologue chez la levure définit le nombre de copies et la localisation des transgènes, tandis que la recombinaison hétérologue de la plupart des eucaryotes les intègre au hasard et en nombre de copies variable.

💡 Astuce mémo

Simple échange : ajout ; double échange : remplacement

📖 4. Expression des gènes procaryotes et eucaryotes

★ À maîtriser

• Les transcrits eucaryotes reçoivent une coiffe en 5′ et une queue poly(A) en 3′, sont épissés dans le noyau, puis exportés vers le cytoplasme où le ribosome se fixe à la coiffe et initie généralement la traduction au premier AUG rencontré.

• Chez les procaryotes, les ARNm sont traduits pendant leur synthèse, peuvent être monocistroniques ou polycistroniques et n’ont généralement pas de queue poly(A) en 3′.

Compléments

• Chez les eucaryotes, l’ARN polymérase II transcrit les ARNm à partir d’un promoteur dont l’accessibilité dépend de l’état de la chromatine, et la région terminatrice contient généralement un signal de polyadénylation.

• Les ARNm eucaryotes sont typiquement monocistroniques, et leur purification est facilitée par des colonnes d’affinité portant des oligonucléotides oligo(dT) qui retiennent les ARNm et laissent passer les ARN ribosomaux, lesquels représentent typiquement plus de 90 % des ARN totaux.

• La transcription comprend l’initiation au promoteur, l’élongation par ajout de nucléotides à l’extrémité 3′ de l’ARN et la terminaison au niveau d’un terminateur, qui entraîne le détachement de la polymérase et la libération de l’ARNm.

💡 Astuce mémo

Eucaryote : maturation nucléaire ; procaryote : transcription-traduction couplées

📖 5. Régulation de l’expression bactérienne

★ À maîtriser

📌 Chez E. coli, l’enzyme cœur de l’ARN polymérase, composée de α₂ββ′, réalise l’élongation mais ne reconnaît pas les promoteurs, tandis que l’holoenzyme comprend en plus un facteur σ qui permet leur reconnaissance.

• Le facteur σ général est σ70 chez E. coli et σA chez Bacillus subtilis et beaucoup d’autres bactéries ; il aide l’ARN polymérase à reconnaître les boîtes -35 et -10 du promoteur et est relargué après l’incorporation des premiers nucléotides.

📌 Un répresseur fixé à l’opérateur inhibe la transcription en empêchant l’accès de l’ARN polymérase au promoteur ou en bloquant sa progression s’il est fixé en aval du promoteur.

Compléments

• Chez E. coli, les séquences consensus -35 et -10 de σ70 sont respectivement TTGACA et TATAAT, séparées par 16 à 18 paires de bases.

📌 Un activateur stimule l’initiation de la transcription, notamment en stabilisant le complexe ARN polymérase-σ sur le promoteur.

• Dans l’opéron lac, LacI complexé à un inducteur dérivé du lactose réprime la transcription, tandis que CAP liée à l’AMPc l’active lorsque la cellule manque d’une source carbonée préférentielle comme le glucose.

• 🔄 L’initiation de la traduction bactérienne se déroule ainsi :

  1. La boîte de Shine-Dalgarno de l’ARNm s’apparie à l’ARNr 16S.
  2. La sous-unité ribosomale 30S s’attache à l’ARNm.
  3. Un ARNt initiateur chargé est recruté et s’hybride au codon de départ.
  4. La sous-unité 50S rejoint le complexe pour former le ribosome 70S.

💡 Astuce mémo

σ reconnaît le promoteur → l’ARN polymérase initie la transcription

📖 6. Vecteurs d’expression bactériens

🔑 Notions clés & Définitions

• Vecteur d’expression bactérien : Permet d’exprimer une séquence codante d’origine quelconque dans un hôte bactérien, le plus souvent E. coli.

★ À maîtriser

📌 Dans une fusion transcriptionnelle, le gène inséré est situé en aval d’un promoteur et d’un site d’attachement des ribosomes et doit apporter son propre ATG, tandis que dans une fusion traductionnelle, le gène est inséré en phase avec une séquence codante du vecteur pour produire une protéine hybride.

Compléments

• Les vecteurs d’expression bactériens portent des promoteurs forts, souvent inductibles, afin de séparer la croissance de la production de la protéine d’intérêt.

• Les promoteurs tac sont des promoteurs hybrides trp-lac très forts dont les régions -10 et -35 correspondent parfaitement au consensus idéal d’E. coli.

• Une protéine porteuse peut : protéger la protéine hétérologue contre la protéolyse, faciliter sa purification par affinité, influencer la localisation cellulaire du produit final

• Les fusions à la β-galactosidase s’accumulent dans le cytoplasme et peuvent former des corps d’inclusion lorsque leur expression est très élevée, tandis que les fusions à la protéine A de Staphylococcus aureus sont dirigées vers l’espace périplasmique d’E. coli par le peptide signal de la protéine A.

💡 Astuce mémo

Fusion transcriptionnelle : ATG propre ; fusion traductionnelle : lecture en phase

📖 7. Amplification par PCR et RT-PCR des ARN

🔑 Notions clés & Définitions

• PCR : Méthode qui amplifie sélectivement in vitro une séquence d’ADN lorsque les séquences qui la flanquent sont connues.
• RT-PCR : Amplification d’un ARN après sa copie préalable en ADN complémentaire par une transcriptase inverse.

★ À maîtriser

• La PCR associe l’ADN cible, une polymérase thermostable, les quatre dNTP et un excès d’amorces qui s’hybrident de part et d’autre de la cible ; après fusion de l’ADN, l’hybridation des amorces puis leur élongation par la polymérase copient les brins cibles.

• Après n cycles de PCR, l’amplification théorique de la cible est de 2ⁿ fois, mais l’amplification pratique ne dépasse généralement pas un facteur de 10⁵ à 10⁶ à cause de l’épuisement des amorces et des dNTP et de la compétition des brins néosynthétisés avec les amorces lors de l’hybridation.

Compléments

• La PCR nécessite des informations sur les séquences flanquant la cible afin de concevoir les deux amorces complémentaires qui s’hybrident de part et d’autre de celle-ci.

• Les composants de la PCR peuvent être introduits ensemble dans le tube, et les changements de température sont automatisés par un thermocycleur.

• Pour amplifier des ARNm eucaryotes portant une queue polyA, on peut utiliser une amorce oligo-dT qui s’hybride à cette queue et une seconde amorce complémentaire de l’extrémité 5’ de l’ADNc recherché.

• Pour copier les ARNm bactériens, on peut utiliser des mélanges d’oligonucléotides de séquence aléatoire ou des amorces dérivées de séquences géniques connues, ce qui permet ensuite d’amplifier simultanément tous les ARNm.

• La synthèse d’un ADNc double brin à partir d’un ARNm commence par une amorce oligo-dT et une transcriptase inverse, puis l’ARNm est hydrolysé à la soude, l’épingle à cheveux sert d’amorce à la synthèse du second brin et une nucléase S1 digère l’épingle.

💡 Astuce mémo

ARNm → ADNc → PCR

📖 8. Performances et limites de la PCR

★ À maîtriser

• Une réaction de PCR comporte typiquement 20 à 30 cycles, avec environ une minute d’élongation par kilobase d’ADN à amplifier et 20 secondes à une minute pour la dénaturation et l’hybridation.

• Idéalement, la séquence cible devient presque aussi abondante que tout le matériel de départ dans un grand génome, et peut le dépasser largement pour un petit génome ou un ARNm particulier, ce qui permet à la PCR de purifier une séquence.

• Les polymérases courantes font moins d’une erreur par kilobase lors d’une amplification de 20 cycles, mais les erreurs deviennent notables au-delà de 20 cycles.

• Dans une PCR standard, l’efficacité d’amplification diminue rapidement pour les fragments de plus d’environ 2 kb, ce qui favorise la synthèse des fragments les plus courts lorsque plusieurs tailles sont présentes.

Compléments

• Une dénaturation préalable peut libérer l’ADN matrice de débris cellulaires, et une élongation supplémentaire après la PCR peut achever les molécules dont un brin est incomplet.

• Les polymérases à haute fidélité ont un taux d’erreur 5 à 10 fois inférieur grâce à leur activité exonucléase de relecture 3′-5′.

📌 Pour cloner un produit PCR dans un plasmide destiné à une construction génétique, il est recommandé de préparer plusieurs clones et de vérifier par séquençage s’ils sont identiques.

• Dans des conditions normales, la PCR incorpore environ 1 000 à 2 000 bases par minute.

• Des enzymes ou mélanges enzymatiques spécifiques permettent d’amplifier des fragments jusqu’à 50 kb grâce à leur haute processivité, c’est-à-dire leur capacité à rester attachés à l’extrémité 3′ du brin synthétisé.

• Certaines polymérases thermostables ajoutent souvent une adénosine non appariée à l’extrémité 3′ des produits PCR, propriété exploitable pour faciliter leur clonage.

💡 Astuce mémo

Plus de 20 cycles : amplification accrue, mais erreurs plus fréquentes

📖 9. Détection par Southern et Northern blot

🔑 Notions clés & Définitions

• Southern blot : Détection, dans des fragments d’ADN séparés et transférés sur membrane, de ceux qui portent une séquence complémentaire de la sonde.
• Northern blot : Le Northern blot détecte un ARNm particulier dans une préparation et permet d’en évaluer la présence, la taille et l’abondance.

★ À maîtriser

📌 Les blots détectent la présence d’un acide nucléique ou d’une protéine dans le cas du Western blot, mais ne purifient pas ces molécules.

Compléments

• Le Southern blot consiste à séparer des fragments d’ADN par électrophorèse, à les dénaturer et transférer sur une membrane, à bloquer les sites d’attachement libres, à hybrider une sonde marquée, puis à laver et détecter la sonde liée.

• Une digestion totale de l’ADN humain, d’environ 3 × 10⁶ kb, par BamHI génère environ 10⁶ fragments différents, dont un ou quelques-uns peuvent être repérés par une sonde spécifique.

• Le Southern blot peut servir à établir une carte des sites de restriction près de la sonde et à estimer le nombre et la similitude de séquences apparentées dans un génome.

• Les ARN du Northern blot sont séparés sur un gel d’agarose contenant du formaldéhyde afin de les maintenir dénaturés sous forme simple brin; ils sont fixés à la membrane par chaleur à 80 °C pendant 2 h ou par rayonnement UV.

• L’hybridation sur colonies peut cribler une banque à la recherche d’un clone, tandis que l’hybridation sur embryons ou tissus peut localiser l’expression d’un gène ou d’une protéine.

💡 Astuce mémo

Southern détecte l’ADN ; Northern détecte l’ARNm

📖 10. Conception et usages des sondes

★ À maîtriser

• Une sonde nucléique peut être : un gène ou un fragment d’ADN cloné, un produit de PCR, un fragment obtenu par digestion de restriction et purification, une séquence d’ADN synthétisée chimiquement

• En l’absence d’information sur la séquence nucléotidique, des oligonucléotides peuvent être conçus à partir de la séquence d’une protéine par rétro-traduction, mais cette stratégie est réalisable seulement sur environ 8 à 12 acides aminés à cause de la dégénérescence du code génétique.

Compléments

• Une amorce conçue à partir d’un gène peut repérer des séquences proches dans la même espèce ou servir à pêcher le gène d’une autre espèce si la conservation nucléotidique est suffisante, notamment entre exons, en conditions de faible stringence.

• La rétro-traduction a permis de cloner des gènes codant des protéines purifiées dont on connaissait une courte séquence amino-terminale, notamment des hormones ou des enzymes.

• La spectrométrie de masse permet de déterminer une séquence N-terminale à partir de moins d’un microgramme de protéine, soit 5 à 50 pmol.

• La détermination de séquences protéiques peut porter sur la protéine native ou sur des fragments obtenus par traitement trypsique, qui clive après une arginine ou une lysine, ou par bromure de cyanogène, qui clive après une méthionine.

📖 11. Dénaturation et renaturation de l’ADN

🔑 Notions clés & Définitions

• Dénaturation de l’ADN : Séparation de ses deux brins par chauffage ou par des conditions de milieu telles qu’un pH alcalin, l’urée concentrée ou le formamide.
• Température de fusion : Température à laquelle 50 % des brins d’ADN sont dénaturés.
• Renaturation de l’ADN : Réappariement progressif de brins complémentaires déroulés lorsque les conditions initiales sont rétablies lentement.

📝 Points essentiels

• La séparation des brins augmente l’absorption des UV autour de 260 nm, phénomène appelé hyperchromicité, qui permet de suivre la dénaturation d’un acide nucléique.

• Un ADN de pourcentage GC homogène fond brutalement autour d’une Tm, tandis que plusieurs ADN de pourcentages GC différents peuvent produire plusieurs Tm et des paliers de fusion.

• Un refroidissement brutal peut piéger les brins dans des structures partiellement bicaténaires qui ne reformeront pas une structure entièrement bicaténaire sous leur Tm, même en présence du brin complémentaire.

• Dans un génome complexe, les séquences répétées se renaturent plus vite que les séquences uniques parce que leur concentration élevée accélère la rencontre des séquences complémentaires.

• En présence d’un excès de séquence complémentaire, une séquence unique d’un génome complexe s’hybride plus vite avec la séquence ajoutée qu’elle ne retrouve son partenaire initial.

💡 Astuce mémo

La double hélice se referme comme une fermeture à glissière lors du refroidissement progressif

📖 12. Spécificité et stringence d’hybridation

★ À maîtriser

📌 Les hybrides formés avec une séquence parfaitement complémentaire ont une Tm différente de ceux formés avec une séquence divergente, car le nombre de ponts hydrogène établis diffère.

📌 Les conditions stringentes, obtenues à température élevée, ne révèlent que les hybrides très complémentaires, tandis que les conditions de faible stringence permettent aussi de détecter des hybrides plus divergents.

📐 Formule - Pour un oligonucléotide court d’environ 20 nucléotides ou moins, dans des conditions standards, $T_m (°C) = 2 °C \times n_{A:T} + 4 °C \times n_{G:C} - 5 °C \times n_{mésappariements}$.

Compléments

• Deux séquences peuvent s’apparier sans être homologues sur toute leur longueur, notamment en présence de substitutions, d’insertions ou de délétions.

• Une augmentation de la température ou l’ajout d’agents chaotropes comme la formamide accroît la stringence de l’hybridation.

• L’oligonucléotide GGATTCATACG a une Tm de 32 °C avec une cible complémentaire à 100 %, et de 25 °C si une paire AT ne peut se former.

💡 Astuce mémo

Forte stringence : hybrides proches ; faible stringence : hybrides plus divergents

📖 13. Origine et marquage des sondes

★ À maîtriser

• La plupart des sondes utilisées aujourd’hui sont des oligonucléotides synthétiques de séquence définie, obtenus par synthèse chimique automatisée.

Compléments

• Une sonde peut notamment être :

  • un ARN purifié
  • l’ADNc de cet ARN
  • un fragment de restriction
  • un produit PCR

• Les rendements de couplage supérieurs à 99 % permettent d’obtenir des oligonucléotides simple brin de plus de 50 à 100 nucléotides.

• Les sondes longues double brin de plus de 500 pb sont marquées principalement par déplacement de coupure ou par amorçage aléatoire, à l’aide de l’ADN polymérase I bactérienne ou du fragment de Klenow.

📖 14. Renaturation selon la complexité de l’ADN

★ À maîtriser

• L’ADN du bactériophage T4 se renature en quelques secondes, tandis que l’ADN fragmenté d’Escherichia coli nécessite des heures.

• Les petits plasmides de moins de 50 kpb se renaturent très rapidement, car leurs deux brins sont topologiquement inséparables.

• Après dénaturation thermique ou alcaline d’un lysat bactérien, un refroidissement ou une neutralisation rapides permettent aux plasmides de se renaturer et de rester en solution, tandis que l’ADN chromosomique demeure dénaturé et précipite avec les protéines cellulaires.

Compléments

• Les génomes eucaryotes contiennent une grande proportion de séquences d’ADN répétées, ce qui rend leurs cinétiques de réappariement complexes.

💡 Astuce mémo

T4 renature en secondes, E. coli en heures

📖 15. Marquage des sondes nucléiques

★ À maîtriser

• 🔄 Le marquage par amorçage aléatoire suit ces étapes :
  1. Dénaturer l’ADN à marquer.
  2. Hybridiser des amorces aléatoires de six ou neuf nucléotides.
  3. Étendre les amorces avec le fragment de Klenow et des dNTP dont au moins un est marqué.

• 🔄 Le déplacement de brèche procède ainsi :

  1. La DNase I introduit des coupures aléatoires sur un brin.
  2. L’ADN polymérase I allonge les extrémités 3’OH.
  3. La polymérase digère le brin lésé dans le sens 5’ vers 3’.
  4. La polymérase recopie la matrice exposée en incorporant les nucléotides marqués.

• L’ADN polymérase I possède trois activités :

  • Une activité polymérase 5’ vers 3’.
  • Une activité exonucléase 3’ vers 5’ de relecture.
  • Une activité exonucléase 5’ vers 3’ qui déplace le brin apparié à la matrice.

📌 Le fragment de Klenow, obtenu par clivage protéolytique du domaine exonucléase 5’ vers 3’, conserve les activités polymérase et relecture, mais ne déplace plus le brin apparié et s’arrête lorsqu’il le rencontre.

Compléments

• Les sondes radioactives peuvent incorporer des dNTP portant en position α un isotope du phosphore 32P ou 33P, ou du soufre 35S, lequel remplace un oxygène du groupement phosphate.

• Une sonde froide peut incorporer une base substituée dont le substituant, exposé hors des sillons de l’ADN double brin, est reconnu par un anticorps spécifique détectable par un signal coloré ou luminescent.

• Lorsque la séquence de la sonde est connue, des amorces marquées correspondant aux extrémités de la molécule permettent de la marquer par PCR.

📖 16. Détection des protéines par western blot

★ À maîtriser

• En western blot, le SDS et l’ébullition dénaturent les protéines et les recouvrent de charges négatives ; la SDS-PAGE les sépare principalement selon leur taille, puis un champ électrique les transfère sur une membrane.

• Après le transfert en western blot, la membrane est bloquée avec une solution protéique, incubée avec un anticorps primaire spécifique, puis révélée grâce à une molécule marquée qui se lie à cet anticorps.

Compléments

• Le marquage de révélation peut être :

  • Enzymatique.
  • Chimioluminescent.
  • Fluorescent.

• Le western blot renseigne sur la masse moléculaire, l’abondance et l’état de la protéine, notamment sa résistance ou sa sensibilité aux protéases et éventuellement son état de maturation.

💡 Astuce mémo

Séparer, transférer, bloquer, détecter

📖 17. Construction et taille des banques génomiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Banque génomique : Collection de clones individuels portant chacun un fragment du génome de l’organisme de départ ; elle est complète si l’ensemble de ses inserts recouvre tout ce génome.

★ À maîtriser

• La fragmentation aléatoire du génome augmente la probabilité qu’un gène soit présent en entier sur au moins un fragment cloné.

• Une digestion partielle par enzyme de restriction, choisie pour couper en moyenne moins d’un site sur dix, produit des fragments chevauchants et réduit le risque que la séquence recherchée soit coupée en plusieurs morceaux.

Compléments

• Les banques génomiques servent notamment au séquençage d’un génome et à la recherche puis à l’analyse d’un gène d’intérêt ; chez les eucaryotes, la recherche du support génétique d’une activité se fait de préférence à partir d’une banque d’ADNc.

• La formule de Clarke et Carbon estime la probabilité P de trouver une séquence dans n clones à partir de la longueur moyenne des fragments l et de la taille du génome G : $P = 1-(1-l/G)^n$, avec l’approximation $P = 1-e^{-nl/G} = 1-e^{-a}$, où a représente le rapport de la taille de la banque à celle du génome.

• Sau3AI coupe environ toutes les 300 pb et convient aux banques plasmidiques ou phagiques contenant des fragments de 5 à 10 kpb, tandis que BamHI coupe environ tous les 4 kb et convient aux banques de YAC.

📖 18. Criblage des banques génomiques

★ À maîtriser

📌 Le criblage biologique repère des clones par le phénotype conféré par le gène cloné ou par complémentation d’une mutation, mais l’expression directe est limitée par l’incompatibilité entre les systèmes d’expression du donneur et de l’hôte.

• Le criblage immunologique transfère les colonies ou plages de lyse sur une membrane, où les protéines s’adsorbent ; des anticorps spécifiques se fixent aux protéines recherchées et sont détectés par un réactif marqué reconnaissant les IgG.

• Le criblage par hybridation transfère les clones sur un filtre en conservant leur disposition, puis hybride une sonde marquée à leur ADN ; le signal sur le filtre permet de retrouver le clone correspondant, selon une technique de type Southern blot.

Compléments

• La complémentation de mutants thermosensibles de la ligase d’Escherichia coli a permis de cloner le gène de la ligase du phage T4 et de surproduire cette enzyme.

• Le criblage immunologique peut employer des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ; ces derniers permettent d’augmenter la spécificité de la détection.

💡 Astuce mémo

Le criblage biologique sélectionne un phénotype, l’hybridation repère une séquence

📖 19. Criblage d’une banque métagénomique

🔑 Notions clés & Définitions

• PCR nichée : Consiste à réaliser deux PCR successives avec deux couples d’amorces différents, le second couple s’hybridant sur le produit de la première PCR.

★ À maîtriser

• Dans le criblage par PCR nichée de la banque métagénomique, la première PCR avec les amorces F1 et R1 a produit un fragment d’environ 750 pb, utilisé comme matrice pour une seconde PCR avec F2 et R2 qui a produit un fragment de 350 pb.

• Le gène xym1 code une protéine de 443 acides aminés qui présente 83 % d’identité avec une xylose isomérase de Sorangium cellulosum.

• Le criblage par complémentation fonctionnelle transfère la banque dans E. coli HB101 xylA− et sélectionne les clones capables de pousser sur milieu minimum supplémenté en xylose.

• Les plasmides des clones sélectionnés par complémentation contenaient un insert d’environ 2,5 kb ; leur séquençage a révélé xym2, qui code une protéine de 442 acides aminés présentant 73 % de similarité avec une xylose isomérase de Robiginitalea biformata et 67 % d’identité avec Xym1.

Compléments

• La métagénomique étudie le matériel génétique collectif des microorganismes d’un environnement ; le TD porte sur le criblage d’une banque d’ADN métagénomique de sol pour identifier des gènes d’enzymes du catabolisme du xylose.

• Les amorces dégénérées contiennent des positions pouvant correspondre à plusieurs nucléotides et permettent de cibler des régions conservées malgré les différences entre séquences homologues.

• Le produit de PCR nichée a été purifié sur gel d’agarose, cloné dans le système Easy Vector de pGEM-T et séquencé ; la séquence obtenue appartenait à un gène codant une xylose isomérase.

• La séquence codante complète de xym1 a été obtenue en amplifiant par PCR les régions situées en amont et en aval du fragment connu de 350 pb.

💡 Astuce mémo

Amorces dégénérées, PCR nichée, séquençage

📖 20. Validation fonctionnelle des xylose isomérases

★ À maîtriser

• Pour valider les xylose isomérases, les séquences xym1 et xym2 ainsi que xylA de Piromyces sp. comme témoin positif ont été surexprimées chez E. coli HB101 et chez une souche de Saccharomyces cerevisiae dépourvue de xylose isomérase, puis la croissance a été évaluée en milieu minimum additionné de xylose.

Compléments

• Les expériences d’expression utilisent pRSETB chez E. coli et p426TEF chez Saccharomyces cerevisiae.