Fiche de révision : Séquençage et structure des protéines

📋 Plan du Cours

1. Généralités et rôles des lipides
2. Acides gras et propriétés
3. Glycérides et lipides membranaires
4. Isoprénoïdes et acides aminés
5. Structure et classification des acides aminés
6. Propriétés physicochimiques des acides aminés
7. Réactions et analyse des acides aminés
8. Structure et séquençage des peptides
9. Détermination des séquences peptidiques
10. Méthodes de clivage des peptides
11. Peptides et hormones actifs
12. Structures tridimensionnelles des protéines
13. Propriétés physico-chimiques des protéines
14. Séparation et dosage des protéines
15. Fonctions et méthodes de purification
16. Classification des protéines
17. Hémoglobine et pigments respiratoires
18. Nature et rôles des glucides

📖 1. Généralités et rôles des lipides

★ À maîtriser

📌 Les lipides simples contiennent uniquement du carbone, de l’hydrogène et de l’oxygène, tandis que les lipides complexes contiennent aussi du phosphore, de l’azote ou du soufre.

• Les acides gras libres circulent dans le sang liés à l’albumine, tandis que le cholestérol, les triglycérides et les phospholipides circulent dans des complexes lipoprotéiniques.

• Les lipides assurent des isolations électrique, mécanique et thermique, servent de précurseurs moléculaires et constituent une source d’énergie.

• Les phospholipides et les sphingolipides, molécules amphiphiles, sont des composants essentiels des membranes cellulaires.

Compléments

• Les quatre classes majeures de lipoprotéines sont :
  • les HDL
  • les LDL
  • les VLDL
  • les chylomicrons

💡 Astuce mémo

Hydrophobe dans l’eau, soluble dans les solvants organiques

📖 2. Acides gras et propriétés

🔑 Notions clés & Définitions

• Acide gras : Acide carboxylique constitué d’une longue chaîne aliphatique, généralement linéaire et à nombre pair de carbones, mais pouvant aussi être impair ou ramifié.

★ À maîtriser

📌 Un acide gras saturé ne possède aucune double liaison, tandis qu’un acide gras insaturé en possède une ou plusieurs.

📌 Les acides linoléique (18:2 ω-6) et linolénique (18:3 ω-3) sont indispensables, tandis qu’aucun acide gras des familles ω-7 et ω-9 ne l’est.

Compléments

• L’acide butyrique, plus petit acide gras mentionné, comporte 4 carbones.

• Les acides palmitique (C16:0) et stéarique (C18:0) sont les acides gras les plus répandus.

• La configuration cis est la configuration la plus répandue des doubles liaisons des acides gras insaturés, et une double liaison crée un coude rigide d’environ 30° dans la molécule.

💡 Astuce mémo

Plus de carbones : fusion accrue ; plus de doubles liaisons : fusion réduite

📖 3. Glycérides et lipides membranaires

🔑 Notions clés & Définitions

• Triglycéride : Acyl-glycérol formé par l’association des trois fonctions alcool du glycérol avec les carboxyles de trois acides gras.

• Glycérophospholipide : Dérivé de l’acide phosphatidique constitué d’un 1,2-diglycéride lié à un alcool par une liaison phosphodiester.

★ À maîtriser

📌 Dans les sphingolipides, la sphingosine liée à un acide gras par une liaison amide forme un céramide ; le céramide lié à un sucre donne un glycosphingolipide, tandis que sa liaison à la phosphorylcholine forme une sphingomyéline.

Compléments

📌 Les monoglycérides sont plus solubles dans l’eau que les diglycérides, tandis que les triglycérides sont insolubles dans l’eau.

• L’hydrolyse des glycérides se fait in vitro en milieu acide et à chaud, et in vivo par hydrolyse enzymatique sous l’action de la lipase dans l’intestin grêle.

• L’indice de saponification est la masse de KOH en mg nécessaire à la saponification de 1 g de lipides.

💡 Astuce mémo

Dans la micelle, les têtes hydrophiles regardent l’eau et les chaînes lipophiles se cachent au centre

📖 4. Isoprénoïdes et acides aminés

🔑 Notions clés & Définitions

• Isoprénoïde : Dérivé de l’isoprène, le 2-méthyl-1,3-butadiène, dont la diversité dépend du nombre de molécules condensées, de leur mode de condensation et de modifications ultérieures.
• Acide aminé : Un acide aminé est le constituant de base des protéines et possède une fonction carboxylique et une fonction amine primaire ; dans un acide α-aminé, ces deux fonctions sont portées par le même carbone α.

📝 Points essentiels

• Les isoprénoïdes comprennent les terpènes et les stéroïdes, sont peu ou pas solubles dans l’eau et sont solubles dans les solvants organiques.

• Les protéines sont des composés quaternaires formés de carbone, d’hydrogène, d’oxygène et d’azote, auxquels s’associent souvent du soufre et du phosphore.

📌 Les oligopeptides comprennent 2 à 10 acides aminés, les polypeptides 11 à 100 acides aminés et les protéines plus de 100 acides aminés.

📖 5. Structure et classification des acides aminés

🔑 Notions clés & Définitions

• Acide α-aminé : Porte une fonction carboxyle et une fonction amine primaire sur le même carbone α.

★ À maîtriser

• Le carbone α d’un acide aminé est lié à quatre groupements différents et est donc asymétrique, sauf chez la glycine.

• Les acides aminés indispensables cités sont :

  • la valine
  • la leucine
  • l’isoleucine
  • la thréonine
  • la méthionine
  • la lysine
  • la phénylalanine
  • le tryptophane

Compléments

📌 Les acides aminés des protéines naturelles appartiennent généralement à la série L, tandis que des acides aminés de configuration D se rencontrent dans certains produits naturels, notamment des antibiotiques peptidiques.

• La glycine est très abondante dans le collagène et l’élastine.

• La cystine se forme par condensation de deux résidus cystéine avec création d’un pont disulfure S–S, et elle est abondante dans les scléroprotéines des phanères.

📖 6. Propriétés physicochimiques des acides aminés

🔑 Notions clés & Définitions

• Ampholyte : Possède à la fois une fonction acide faible et une fonction basique faible.
• Point isoélectrique : Le point isoélectrique pHi est le pH auquel un acide aminé présente une charge nette nulle sous forme zwitterionique.

★ À maîtriser

📐 Formule - Pour un acide aminé sans chaîne latérale ionisable, $pHi = \frac{pK_1+pK_2}{2}$.

📌 À un pH inférieur au pHi, l’acide aminé porte une charge nette positive et migre vers la cathode ; à un pH supérieur au pHi, il porte une charge nette négative et migre vers l’anode.

Compléments

• Les pK d’ionisation sont de l’ordre de 2 pour les fonctions carboxyliques et de 9 pour les fonctions amines.

• La solubilité aqueuse des acides aminés diminue généralement quand le nombre d’atomes de carbone du radical R augmente, et elle augmente avec la présence de fonctions polaires ou hydrophiles sur ce radical.

💡 Astuce mémo

Sous pHi : cation vers la cathode ; au-dessus de pHi : anion vers l’anode.

📖 7. Réactions et analyse des acides aminés

★ À maîtriser

• La transamination transfère, en présence d’une transaminase et de vitamine B6, la fonction amine d’un acide aminé à un acide α-cétonique.

• La réaction à la ninhydrine désamine et décarboxyle les acides aminés, puis forme un produit bleu-violet appelé pourpre de Ruhemann, absorbant à 570 nm.

• En chromatographie sur papier, les acides aminés se répartissent entre une phase stationnaire polaire et une phase mobile organique ; les molécules non polaires migrent généralement plus vite que les molécules polaires.

• 🔄 L’ordre d’élution des acides aminés est :

  1. les acides aminés acides
  2. les acides aminés neutres
  3. les acides aminés basiques

Compléments

• L’ASAT catalyse le transfert de la fonction amine du glutamate à l’oxaloacétate, produisant de l’α-cétoglutarate et de l’aspartate.

• L’ALAT catalyse le transfert de la fonction amine du glutamate au pyruvate, produisant de l’α-cétoglutarate et de l’alanine.

📌 La proline et l’hydroxyproline donnent une coloration jaune à la ninhydrine, avec une absorption à 460 nm, contrairement à la coloration bleu-violet habituelle des autres acides aminés.

📐 Formule - En chromatographie, le rapport frontal est $Rf = \frac{\text{distance parcourue par la substance}}{\text{distance parcourue par le front du solvant}}$.

• La méthode de Moore et Stein (1949) sépare les acides aminés selon leurs charges globales au moyen de résines échangeuses d’ions.

• La méthode automatisée sur échangeur de cations décrite permet la séparation, l’identification et le dosage quantitatif des acides aminés en moins de 3 heures, avec une sensibilité de 10 nmoles.

💡 Astuce mémo

Pour séparer sur échangeur de cations : acides, puis neutres, puis basiques.

📖 8. Structure et séquençage des peptides

🔑 Notions clés & Définitions

• Peptide : Constitué d’acides aminés associés par des liaisons peptidiques, formées par amidification de la fonction carboxyle d’un acide aminé par la fonction amine du suivant avec libération d’eau.

★ À maîtriser

📌 Un peptide de 2 à 10 résidus est un oligopeptide, tandis qu’un peptide de plus de 10 résidus est un polypeptide.

📌 Dans l’écriture conventionnelle d’un peptide, l’acide aminé N-terminal portant la fonction amine libre se place à gauche et l’acide aminé C-terminal portant la fonction carboxyle libre se place à droite.

• Dans la liaison peptidique, les atomes C, H, N, O et les deux carbones α sont dans un même plan, et les carbones α sont en position trans par rapport à la liaison C–N.

📌 La résonance de la liaison peptidique lui confère un caractère partiellement double, ce qui empêche sa libre rotation.

Compléments

• Dans la nomenclature d’un peptide, le suffixe « yle » est ajouté au nom de chaque acide aminé sauf à celui de l’acide aminé C-terminal.

• La première séquence complètement déterminée fut celle de l’insuline, établie par Sanger en 1955.

📖 9. Détermination des séquences peptidiques

★ À maîtriser

• La détermination d’une séquence peptidique repose sur l’identification des acides aminés N- et C-terminaux, l’analyse de la composition après hydrolyse en fragments séparés selon leur masse ou leur charge, puis la comparaison de fragments chevauchants produits par différentes méthodes et la vérification des séquences possibles avec les données expérimentales.

• La méthode de Sanger marque le groupe α-NH2 libre de l’acide aminé N-terminal avec le DNFB, puis l’hydrolyse totale libère cet acide aminé sous forme de dérivé dinitrophénylé identifiable par chromatographie.

• 🔄 La dégradation d’Edman procède en trois transformations :

  1. Le PITC se lie à l’acide aminé N-terminal en milieu légèrement alcalin.
  2. Un acide fort anhydre libère le résidu sous forme de dérivé thiazolinone.
  3. Le dérivé est transformé en PTH, puis identifié le plus souvent par HPLC.

Compléments

• Le nombre d’arrangements possibles de n acides aminés différents est n!, et un tripeptide composé de A, B et C possède six séquences possibles : ABC, BCA, CAB, CBA, ACB et BAC.

• Le chlorure de dansyl marque les amines primaires, y compris le groupe ε-aminé de la lysine, et sa méthode est 100 fois plus sensible que celle de Sanger.

• La leucine aminopeptidase libère progressivement les acides aminés N-terminaux, mais n’agit pas lorsque l’acide aminé N-terminal est une proline.

• L’hydrazinolyse d’Akabori coupe les liaisons peptidiques par l’hydrazine, sauf la liaison du résidu C-terminal, qui est libéré et identifié par chromatographie sur colonne.

• Les carboxypeptidases hydrolysent successivement la liaison peptidique au niveau du carboxyle libre et libèrent ainsi les acides aminés C-terminaux de proche en proche.

💡 Astuce mémo

Repérer les extrémités, fragmenter, puis faire chevaucher les fragments.

📖 10. Méthodes de clivage des peptides

📝 Points essentiels

• Le bromure de cyanogène clive spécifiquement les polypeptides du côté carboxylique des résidus méthionine.

• La trypsine coupe les liaisons peptidiques au niveau du carboxyle des résidus basiques lysine ou arginine.

• La chymotrypsine coupe au niveau du carboxyle de ces résidus :

  • leucine
  • phénylalanine
  • tyrosine
  • tryptophane

💡 Astuce mémo

BrCN cible la méthionine, tandis que les endopeptidases ciblent certaines liaisons internes.

📖 11. Peptides et hormones actifs

★ À maîtriser

• Le glutathion est le tripeptide γ-L-glutamyl-L-cystéinyl-glycine, dans lequel le carboxyle γ du glutamate amidifie la cystéine.

• Le glutathion réduit protège l’hémoglobine de l’oxydation en méthémoglobine et contribue à la production de NADP réduit qui alimente la voie des pentoses.

• L’ocytocine est une hormone post-hypophysaire nonapeptidique qui contracte l’utérus et dont la structure a été synthétisée par Du Vigneaud.

• La vasopressine est une hormone post-hypophysaire antidiurétique et hypertensive, et la forme bovine porte l’arginine en position 8.

• L’ACTH est un polypeptide monocaténaire de 39 acides aminés, d’environ 4 500 Da, qui stimule le cortex surrénalien à libérer le cortisol.

• L’insuline est une hormone hypoglycémiante sécrétée par les cellules bêta du pancréas, constituée de 51 acides aminés répartis entre les chaînes A (21) et B (30), reliées par des ponts disulfure, et son poids moléculaire est d’environ 5 734 Da.

• Le glucagon est un polypeptide monocaténaire de 29 acides aminés, sécrété par les cellules alpha des îlots de Langerhans, qui élève la glycémie et a un poids moléculaire d’environ 3 482 Da.

📌 La calcitonine, sécrétée par les cellules thyroïdiennes, diminue la calcémie et augmente la phosphorémie, tandis que la PTH augmente la calcémie et diminue la phosphorémie.

Compléments

• La carnosine est un dipeptide β-alanyl-L-histidine présent dans le muscle et la viande fraîche, où sa diazoréaction de Pauly est positive.

• L’ansérine est un dipeptide formé par amidification de la β-alanine par la méthyl-L-histidine et se trouve dans les muscles d’oiseaux.

• La TRH est un tripeptide hypothalamique de séquence pyroglutamyl-histidyl-prolinamide qui libère la thyréostimuline hypophysaire.

• Les enképhalines sont des pentapeptides cérébraux antidouleur qui se fixent sur les récepteurs stéréospécifiques des opiacés : la Leu-enképhaline est Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu et la Met-enképhaline est Tyr-Gly-Gly-Phe-Met.

• La LH-RH, ou Gn-RH, est un décapeptide hypothalamique qui libère l’hormone lutéinisante hypophysaire.

• La GH humaine est une hormone antéhypophysaire formée de 188 acides aminés et d’environ 21 500 Da.

📖 12. Structures tridimensionnelles des protéines

🔑 Notions clés & Définitions

• Structure primaire : L’enchaînement linéaire ordonné des acides aminés reliés par des liaisons peptidiques, imposé par le génome et déterminant les structures secondaire et tertiaire.
• Structure secondaire : Les relations spatiales régulières entre les résidus d’acides aminés proches dans la séquence linéaire, notamment l’hélice α, le feuillet plissé β et le coude β.
• Structure tertiaire : Le repliement d’une chaîne polypeptidique sur elle-même, impliquant notamment des ponts disulfure et des interactions hydrophobes, hydrogène et électrostatiques entre résidus parfois éloignés dans la séquence.
• Structure quaternaire : L’association de plusieurs sous-unités identiques ou différentes par des interactions non covalentes, sans liaison covalente entre elles.

📝 Points essentiels

• L’hélice α est stabilisée par des liaisons hydrogène intramoléculaires entre les résidus n et n+4, tandis que ses chaînes latérales pointent vers l’extérieur.

• Le feuillet plissé β est stabilisé par des liaisons hydrogène entre des chaînes peptidiques disposées côte à côte, et ses chaînes latérales se dressent au sommet des arêtes.

📖 13. Propriétés physico-chimiques des protéines

★ À maîtriser

• La solubilité des protéines est minimale au voisinage de leur pH isoélectrique, où l’absence de charge nette favorise leur agrégation.

• Les électrolytes dilués à faible force ionique favorisent généralement la solubilisation des protéines, tandis que les électrolytes concentrés provoquent le relargage et leur insolubilisation.

• Au voisinage de son pHi, une protéine est peu soluble ; à un pH inférieur à son pHi, elle est chargée positivement et migre vers la cathode, tandis qu’à un pH supérieur, elle est négative et migre vers l’anode.

Compléments

• La force ionique d’une solution est donnée par $\mu=\frac{1}{2}\sum_i c_i z_i^2$, où $c_i$ est la concentration de l’ion i et $z_i$ sa valence.

• La solubilité des protéines augmente avec la température jusqu’à 40 °C, puis leur dénaturation et leur précipitation sont favorisées au-delà de 40 °C.

• Les protéines ont une masse moléculaire généralement comprise entre $10^4$ et $10^6$ Da, ce qui rend inadaptées les méthodes habituelles destinées aux petites molécules.

💡 Astuce mémo

Sous le pHi, la protéine est positive ; au-dessus, elle est négative.

📖 14. Séparation et dosage des protéines

🔑 Notions clés & Définitions

• Volume d’élution : Le volume nécessaire pour éluer un soluté de la colonne après son dépôt sur le gel.

★ À maîtriser

• En filtration sur gel, les molécules plus grandes que les pores sont exclues du gel et éluées avant les molécules plus petites, qui diffusent dans les pores.

• La masse moléculaire d’une protéine inconnue peut être estimée en comparant son volume d’élution relatif à celui de protéines étalons de masses connues, car ce volume varie linéairement avec le logarithme de la masse moléculaire.

• La réaction du Biuret donne aux protéines une coloration bleue violacée ou pourpre, avec un maximum d’absorption à 540 nm.

Compléments

📐 Formule - Le volume total d’une colonne de filtration sur gel vérifie $V_t=V_x+V_0$, et le volume mort $V_0$ représente généralement 35 % de $V_t$.

• En filtration sur gel, le rapport $V_e/V_0$ caractérise le cheminement d’un soluté et est indépendant des dimensions de la colonne utilisée.

💡 Astuce mémo

En filtration sur gel, les grosses molécules sortent d’abord ; en dialyse, les petites traversent la membrane.

📖 15. Fonctions et méthodes de purification

🔑 Notions clés & Définitions

• Dialyse : Une séparation des molécules selon leur taille au moyen d’une membrane semi-perméable qui laisse diffuser les petites molécules et retient les macromolécules.

★ À maîtriser

• Les enzymes sont des catalyseurs protéiques capables d’amplifier la vitesse des réactions.

• L’hémoglobine transporte l’oxygène, tandis que la ferritine stocke le fer.

• La contraction musculaire résulte de l’interaction entre l’actine et la myosine, et la myosine facilite la conversion de l’énergie chimique de l’ATP en énergie mécanique.

📌 La solubilité d’une protéine est minimale à son point isoélectrique, où sa charge nette est nulle ; au-dessus de ce pH, sa charge nette est négative et au-dessous, elle est positive.

Compléments

• Un sac de dialyse courant retient les molécules dont la masse dépasse environ 15 kDa, tandis que les plus petites passent dans le dialysat.

• L’ultrafiltration concentre une solution macromoléculaire en la forçant sous pression à travers une membrane semi-perméable qui laisse passer le solvant et les petites molécules.

📖 16. Classification des protéines

★ À maîtriser

📌 Les protéines fibrillaires ont un rapport axial supérieur à 10, tandis que les protéines globulaires ont un rapport axial inférieur à 10 et des chaînes repliées et compactes.

• Le collagène, riche en proline, fournit une forte résistance à la traction aux tissus conjonctifs, notamment par la réticulation de ses fibres.

• Les hétéroprotéines associent une protéine à un groupement non protéique appelé groupement prosthétique.

• Les lipoprotéines humaines, de la plus grande à la plus petite, sont :

  • Chylomicrons
  • VLDL
  • LDL
  • HDL

Compléments

• La kératine, riche en cystéine, stabilise sa structure tertiaire par des ponts disulfure qui peuvent être réduits pour la rendre plus souple puis rétablis par oxydation.

• Les histones sont des protéines basiques de faible poids moléculaire associées à l’ADN nucléaire des eucaryotes pour former la chromatine.

• Le sérum contient environ 66 à 75 g de protéines par litre, et l’albumine en représente environ 50 %.

💡 Astuce mémo

Fibrillaire : fibre résistante ; globulaire : chaîne repliée et compacte.

📖 17. Hémoglobine et pigments respiratoires

★ À maîtriser

• La myoglobine musculaire a une masse moléculaire de 16 700 Da, tandis que l’hémoglobine des globules rouges a une masse moléculaire de 64 500 Da.

📌 L’hème contient du fer ferreux Fe²⁺, tandis que l’hématine contient du fer ferrique Fe³⁺ et ne transporte pas l’oxygène sous cette forme de méthémoglobine.

• L’hémoglobine adulte HbA est constituée de deux chaînes α et de deux chaînes β, tandis que l’HbA₂ associe deux chaînes α et deux chaînes δ et représente environ 3 % de l’hémoglobine adulte.

Compléments

• L’hémoglobine fœtale HbF a pour structure α₂γ₂, tandis que l’hémoglobine embryonnaire décrite a pour structure α₂ε₂.

📖 18. Nature et rôles des glucides

🔑 Notions clés & Définitions

• Glucide : Molécule organique constituée d’une chaîne carbonée portant une fonction carbonyle, aldéhyde ou cétone, et plusieurs fonctions hydroxyle.
• Osides : Composés qui libèrent par hydrolyse deux molécules d’oses ou davantage ; les holosides ne contiennent que des oses, tandis que les hétérosides associent des oses à une partie non glucidique appelée aglycone.
• Chromatographie : Méthode de séparation des constituants d’un mélange fondée sur leurs affinités différentes pour une phase stationnaire et une phase mobile appelée éluant.
• Chromatographie : Méthode physique de séparation fondée sur les affinités différentes des substances pour une phase stationnaire et une phase mobile, appelée éluant.

📝 Points essentiels

• Les glucides fournissent 40 à 50 % des calories de l’alimentation humaine et constituent une source d’énergie immédiatement utilisable sous forme de glucose ou mise en réserve sous forme de glycogène chez les animaux et d’amidon chez les végétaux.

• Le glucose est le principal carburant des tissus, le seul carburant du fœtus, et les glucides alimentaires sont absorbés sous forme de glucose ou convertis en glucose dans le foie.

📌 Les oses sont des sucres simples non hydrolysables, tandis que les osides libèrent par hydrolyse au moins deux molécules d’oses, identiques ou différentes.

• Un ose se classe selon la nature de son carbonyle, aldéhyde pour un aldose ou cétone pour un cétose, et selon son nombre de carbones, de 3 à 7.

• La mutarotation du glucose correspond à la conversion en solution de ses anomères α et β ; leur pouvoir rotatoire évolue respectivement de +112,2° et +18,7° vers une valeur d’équilibre de 52,7°.

📌 La cyclisation crée un carbone anomérique, C1 chez les aldoses et C2 chez les cétoses, qui distingue les anomères α et β ; la forme α a le pouvoir rotatoire le plus élevé.

📌 Un diholoside est réducteur s’il conserve une fonction OH semi-acétalique libre ; il est non réducteur lorsque la liaison osidique engage les deux carbones anomériques.

• L’amidon est un polyoside de réserve végétal composé d’amylose linéaire à liaisons α(1→4), représentant 15 à 30 % de sa masse, et d’amylopectine ramifiée à liaisons α(1→4) et α(1→6), représentant 70 à 95 %.

• Le glycogène est une réserve animale présente notamment dans le foie (200 g) et les muscles (100 à 300 g) ; sa structure ressemble à celle de l’amylopectine, mais ses ramifications sont plus fréquentes et ses chaînes plus courtes.

• La cellulose est un polyoside structural végétal constitué de chaînes linéaires de glucose liées en β(1→4), stabilisées par des liaisons hydrogène ; l’être humain ne possède pas de β-glucosidase pour la dégrader.

📐 Formule - La loi de Biot donne l’angle de rotation observé par $\alpha=[\alpha]_{T,\lambda}\,l\,c$, où le pouvoir rotatoire spécifique dépend de la température et de la longueur d’onde, l est la largeur de cuve en dm et c la concentration en g/mL.

📌 Un mélange équimolaire de deux énantiomères est racémique et ne présente pas de pouvoir rotatoire, car leurs déviations opposées s’annulent ; la configuration D ou L ne détermine pas le sens de rotation.

📊 Tableaux de synthèse

Structures des protéines

Comparaison des protéines fibrillaires et globulaires